基于平均核苷酸相似度和16S rDNA技术对全球沙门氏菌的鉴定比对分析

目的评估平均核苷酸相似度(average nucleotide identity,ANI)和16S rDNA技术对沙门氏菌的鉴定能力。方法从GenBank数据库批量下载全球沙门氏菌基因组和相应血清型,以沙门氏菌典型菌株的基因组作为分型菌株。利用fastANI软件,根据默认参数进行ANI分析。使用在线软件SpeciesFinder针对细菌的16S rDNA进行物种和血清型鉴定。结果在下载的2306个基因组中,1767株沙门氏菌存在178种血清型,以鼠伤寒沙门菌323株(18.3%)和肠炎沙门菌300株(17.0%)最为常见。ANI分析显示,以95%为界值时,仅有30株(1.3%)沙门氏菌被分配到1个特定的亚种,其余2276株(98.7%)沙门氏菌均可分配到2~5个亚种;以97%为界值时,2306株(100%)沙门氏菌均可被鉴定到唯一的亚种。基于16S rDNA的分析仅鉴定出1072株(46.5%)沙门氏菌,其中95.2%(1021/1072)的沙门氏菌鉴定的亚种结果与ANI(≥97%)分析鉴定的结果完全一致;与已知的血清型相比,仅有2.4%(19/784)的沙门氏菌与已知的血清型结果一致。结论ANI更适合沙门氏菌的种及亚种鉴定,ANI≥97%可作为沙门氏菌亚种的鉴定标准。16S rDNA技术对于沙门氏菌鉴定的敏感性尚有待提高。

减毒沙门氏菌投递的TGEVS基因疫苗口服免疫猪的动态规律

目的研究TGEV S基因疫苗SL7207(PVAXD-TS)口服免疫仔猪后的动态免疫诱导规律。方法将口服疫苗SL7207(PVAXD-TS)、空载体菌株SL7207(PVAXD)以1.6×1011 CFU/头的剂量口服接种20日龄仔猪,以PBS为空白对照,2周后以2.0×1011 CFU的剂量加强免疫。分别测定0、2、4、6和8周的血清IgG、IgA、TGEV中和抗体、细胞免疫反应IL-4、IFN-γ、外周血淋巴细胞增殖情况。结果仔猪口服免疫后第4周即可检测抗TGEV的特异性IgG和粪黏液IgA抗体;在免疫后第6周IgA、IgG、IL-4、IFN-γ抗体和外周血T淋巴细胞增殖与SL7207(PVAXD)、PBS间均存在统计学差异(P<0.01),并在第6周达到最高值;中和实验显示该疫苗诱导的血清IgG具有中和活性。结论证实以减毒沙门菌为载体的TGEV S基因疫苗口服免疫仔猪有较好的免疫原性。

通过16S rDNA全序列分析及鉴定牛沙门氏菌

通过16S rDNA全序列的DNA同源性分析以及PCR-RFLP分析，对从山东某奶牛场送检的腹泻死亡的犊牛内脏中分离到的一株沙门氏菌进行了血清型鉴定，得到其系统发育树状图。系统发育树分析表明，该沙门氏菌菌株与GENEBANK上发表的27株沙门氏菌的16S rDNA同源性较高，为97-99％，该沙门氏菌菌株与鼠伤寒沙门氏菌LT2（Salmonella typhimurium LT2）的同源性最高，达到了99．7％，表明该沙门氏菌菌株为鼠伤寒沙门氏菌。

携带pcDNA3s与EGFPC3质粒的重组减毒沙门氏菌的免疫性与EGFP的表达

目的研究HBsAg DNA重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的免疫性与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因EGFPC3在小鼠体内的表达。方法将质粒pcDNA3s与pEGFPC3分别电转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/EGFPC3与SL8786/pcDNA3s。利用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)检测小鼠的血清抗体的含量,以及重组菌引起的T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。用荧光显微镜观察EGFPC3表达。结果口服SL8786/p cDNA3s免疫小鼠后,可诱导产生较强的特异性CTL应答。口服免疫小鼠后第11周抗-HBs含量最高。用流式细胞术检测贴壁培养的2只小鼠的脾细胞中SL8786/EGFPC3阳性率分别为19.20%和17.36%,而SL8786/pcDNA3口服的2只小鼠脾细胞中的EGFP阳性率分别仅为1.95%和1.63%。给小鼠口服SL8786/EGFPC33周后,在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠及肌肉等组织中,均有EGFPC3的表达。结论口服SL8786/pcDNA3s在小鼠体内诱导了特异性细胞和体液免疫应答。携带EGFPC3的重组鼠伤寒沙门氏菌SL8786/EGFPC3在小鼠的部分组织中产生绿色荧光表达,该重组菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体基因工程疫苗的研制提供了一个优良模型。

减毒沙门氏菌介导的小鼠肝炎病毒S1基因DNA疫苗的免疫特性分析

根据GenBank公开序列自行设计一对引物,通过RT-PCR扩增出小鼠肝炎病毒的全长S1基因,并将其插入真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-S1。将重组质粒转染COS-7细胞,采用间接免疫荧光检测出S1蛋白的体外表达。将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建出运送DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1)。分别以5×108CFU、1×109CFU、2×109CFU剂量的重组菌口服接种6周龄BALB/c小鼠,试验结果表明,重组菌对小鼠具有良好的安全性。以1×109CFU剂量的重组菌口服免疫小鼠,抗体检测结果显示,在二免后两周和三免后两周,重组菌免疫组的血清抗体水平与SL7207(pVAX1)空载体免疫组间分别存在显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。在三免后两周重组菌免疫组出现了较高水平的肠黏膜抗体。

肠炎沙门氏菌攻毒对SPF雏鸡粪便微生物区系的影响

试验旨在探究肠炎沙门氏菌攻毒对SPF雏鸡粪便微生物区系的影响。选择1日龄SPF雏鸡24只,随机分为2组,每组12只。在4日龄处理组口服107 CFU肠炎沙门氏菌(ATCC13076)攻毒,对照组口服等量PBS溶液。试验期22 d。结果显示:①处理组SPF鸡的存活率为75%,对照组全部存活,期间两组鸡的体重无显著性差异;②OTU水平上,相同日龄两组鸡粪便菌群的丰富度相近,中期处理组粪便菌群多样性更高(P<0.05),后期对照组菌群稳定性更高,而且攻毒对SPF鸡粪便菌群的影响随日龄增加而减弱;③在属水平上,与对照组相比,处理组Bacteroides(拟杆菌门)、Enterococcus(肠球菌属)和Aeriscardovia(卡多维亚氏菌属)的相对丰度明显升高(P<0.05);Lactobacillus(乳杆菌属)、Alistipes(另枝菌属)、Faecalibacterium(粪杆菌属)、Romboutsia(罗姆布茨菌属)和Ruminococcaceae_UCG_005(瘤胃球菌UCG_005)的相对丰度明显降低(P<0.05);④KEGG分析显示攻毒影响了菌群参与的多个代谢通路。综上,肠炎沙门氏菌感染影响了SPF雏鸡粪便菌群的结构组成、稳定性及菌群参与的代谢通路。Bacteroides(拟杆菌门)、Lactobacillus(乳杆菌属)等差异菌属可能对SPF雏鸡抵抗沙门氏菌入侵起到积极作用。

在鼠伤寒沙门氏菌致突变试验中比较人肝细胞和人肝S9与大鼠肝制剂活化系统对激活诱变剂的影响

本文作者使用完整的人肝细胞悬浮液(HHS)和人肝S9混合液(HHS9M)作为代谢活化系统,对10种已知前遗传毒剂包括多环芳烃类、N-亚硝胺类和亚硝酰胺类进行了鼠伤寒沙门氏菌致突变试验(STMA)。从肾脏供体的死者身上摘出肝脏,

生猪肉中沙门氏菌的分离与鉴定

目的建立一套高效的沙门氏菌分离和鉴定方法,同时对本地区生猪肉中沙门氏菌的污染情况做初步评估。方法分别从本地区屠宰场、农贸市场和超市各采集10份生猪肉样品,共计30份。然后对采集的样品进行选择性培养,初步筛选疑似菌株,通过对疑似菌株进一步进行生理生化鉴定、16S rDNA基因序列的比对并构建系统发育树,最终确认沙门氏菌。结果研究表明在采集的30份样品中共获得1株疑似菌株,并通过一系列试验鉴定为沙门氏菌,同时表明该地区生猪肉中沙门氏菌的检出率为3.3%。结论该研究为丰富沙门氏菌数据库资料和流行病学的研究提供一定的理论依据,同时为进一步对该地区肉及肉制品中沙门氏菌的风险评估奠定基础。

一株新型家兔肠炎沙门氏菌的分离鉴定及防治

针对山东省某兔场发生以仔兔脾脏肿大、母兔流产为特征的传染病,本研究对发病濒死兔进行细菌分离,利用16S rRNA基因扩增技术、特异性PCR技术和生化试验对致病细菌进行鉴定,并进行了药敏试验和自制疫苗效力试验。分离菌株16S rRNA基因序列与肠炎沙门氏菌相似度大于99.0%,培养特性和生化特性符合肠炎沙门氏菌特性。分离菌株特异性PCR产物序列与肠炎沙门氏菌sef A基因的同源性为99.3%~100.0%,因此将其命名为Salmonella SD/2016。动物回归试验成功复制出该病并分离到目的细菌。自制疫苗安全性良好,对断奶幼兔能提供免疫保护。

携带TGEV DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及安全性与免疫性分析

【目的】探讨以减毒沙门氏菌为载体,进行TGEV DNA疫苗口服免疫可行性。【方法】通过RT-PCR扩增TGEV四川株(SC-H)S基因5’端约2.1 kb的主要抗原位点片段,将其插入真核表达载体pVAX1,构建重组质粒pVAX-S,体外转染COS-7细胞,间接免疫荧光检测S基因表达。通过电转化将pVAX-S转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建SL7207(pVAX-S)重组菌,并在体外感染小鼠腹腔巨噬细胞,以RT-PCR、间接免疫荧光检测细胞内S基因的转录与表达情况。将SL7207(pVAX-S)重组菌以5×108、1×109、2×109CFU剂量口服接种BALB/c小鼠,分析其安全性,并以1×109CFU剂量的重组菌3次免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA检测免疫小鼠的血清IgG与肠道粘膜IgA抗体。【结果】成功构建重组质粒pVAX-S,且重组质粒能在COS7细胞中表达。重组菌SL7207(pVAX-S)感染巨噬细胞后检测到目的基因的转录、表达。小鼠口服接种不同剂量重组菌,具有良好的安全性。免疫小鼠于二免后两周可检测到针对TGEV S蛋白的特异性血清IgG与肠道粘膜IgA抗体,且三免后两周与SL7207(pVAX1)空载体免疫组间分别存在显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。【结论】携带TGEV DNA疫苗的减毒沙门氏菌小鼠试验显示了良好的免疫原性与安全性。

沙门氏菌比对试验的检验分析

选择鼠伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌分别与检验中常见的5种其它肠杆菌属细菌组合成染菌虾仁模拟样品10组,按照现行的检验标准GB 4789.4-2010进行沙门氏菌检验^([1])。10组样品均能检出沙门氏菌和干扰菌,检验结果准确。在检验过程中发现BS平板需要经过培养48 h才能观察到明显的菌落特征;增菌液培养时间越长,沙门氏菌的生长越好;甲型副伤寒沙门氏菌有微弱产H_2S现象;粘质沙雷氏菌对鼠伤寒沙门氏菌的硫化氢反应有抑制作用;奇异变形杆菌和柠檬酸杆菌与沙门氏菌属A-F多价O诊断血清发生交叉凝集反应现象。培养过程中发现的检测技术问题,在水产品、动物及动物产品的沙门氏菌等肠杆菌属的检验中,都有很好的借鉴意义。

携带IBV DNA疫苗重组减毒沙门氏菌的构建及免疫原性研究

为研究携带IBV DNA疫苗重组减毒沙门氏菌免疫原性,本研究将携带有禽传染性支气管炎病毒(IBV)S1、M、N基因的pVAX1-S1、pVAX1-M和pVAX1-N重组质粒转入减毒沙门氏菌X4550株,构建IBV S1、M、N基因DNA质粒重组减毒沙门氏菌X4550疫苗株(X4550/pVAX1-S1,X4550/pVAX1-M,X4550/pVAX1-N),用间接免疫荧光法(IFA)检测重组质粒体外表达,SPF鸡经口服免疫,测定体内组织分布及稳定性、特异性IgG、IgA、CD4+和CD8+T细胞含量并进行攻毒实验。结果表明,重组质粒可在体外细胞中表达目的蛋白;重组减毒沙门氏菌X4550疫苗株可在肠、脾、肝、心、肾、肺6个组织中分布并稳定存在;特异性IgG,IgA、CD4+和CD8+T细胞显著升高(p<0.01),用104EID50IBV M41株攻毒,保护率达到73%(11/15)。本研究为研制IBV基因减毒沙门氏菌疫苗提供了依据。

鸡肠炎沙门氏菌的分离和药物敏感性分析

2010年10月至2011年10月期间泰州周边地区部分鸡群发病,经诊断怀疑是细菌感染,从患病鸡体内进行细菌分离、常规细菌学检验、16s rRNA序列分析和致病性试验,确定25株肠炎沙门氏菌。对这些分离株进行抗生素敏感试验,结果表明,所有分离株对氨苄青霉素、头孢拉定、链霉素、强力霉素、四环素和萘啶酮酸60～100%耐药,93.5%菌株表现为多重耐药(耐3种以上抗生素)。鸡肠炎沙门氏菌分离株对多种抗生素的敏感性下降,这也是导致临床上用药治疗失败的原因。

以减毒沙门氏菌为载体的小鼠肝炎病毒DNA疫苗的构建及其免疫原性

目的:构建以减毒沙门氏菌为载体的小鼠肝炎病毒DNA疫苗,研究该疫苗的免疫原性。方法:以小鼠肝炎病毒S1基因的重组真核表达质粒pVAX1-S1免疫BALB/c小鼠,ELISA检测其诱导抗体产生情况;再将重组质粒pVAX1-S1电转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建运送S1基因的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1),口服免疫BALB/c小鼠,间接免疫荧光试验鉴定减毒沙门氏菌运送的DNA疫苗的免疫原性。结果:与pVAX1空载体对照组相比,重组真核表达质粒pVAX1-S1免疫组二免及三免后抗体水平分别存在显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。减毒沙门氏菌运送的DNA疫苗SL7207(pVAX1-S1)诱导小鼠产生了特异性的血清抗体。结论:构建的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1)具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生特异性的体液免疫应答。这为进一步研制冠状病毒新型基因疫苗奠定了基础。

VBNC状态鸡白痢沙门氏菌快速诱导条件筛选

为建立VBNC状态沙门氏菌实验室快速诱导条件，以4℃低温诱导为对照组，在此基础上，添加不同浓度Cu^2＋和冰醋酸作为快速诱导条件进行试验。结果表明，在4℃低温条件下，添加2-4 mM Cu^2＋对沙门氏菌进入VBNC状态有明显促进作用，与传统诱导条件相比，诱导时间平均提前15d。对诱导进入VBNC状态的沙门氏菌进行16SrRNA鉴定，结果证明，所得菌为VBNC状态沙门氏菌。

沙门氏菌比对试验的检验分析

目的通过实验,分析检验过程中应注意的问题,提高沙门氏菌的检验水平。方法选择鼠伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌分别与检验中常见的5种其它肠杆菌属细菌组合成染菌虾仁模拟样品10组,按照现行的检验标准:GB 4789.4-2010食品微生物学检验沙门氏菌检验[1],进行分离鉴定。结果10组样品均能检出沙门氏菌和干扰菌,检验结果准确.在检验过程中发现BS平板需要经过培养48h才能观察到明显的菌落特征;增菌液培养时间越长,沙门氏菌的生长越好;甲型副伤寒沙门氏菌有微弱产H2S现象;粘质沙雷氏菌对鼠伤寒沙门氏菌的硫化氢反应有抑制作用;奇异变形杆菌和柠檬酸杆菌与沙门氏菌属A-F多价O诊断血清发生交叉凝集反应现象。结论本实验总结出的培养过程中发现的检测技术问题,在水产品、动物及动物产品的沙门氏菌等肠杆菌属的检验中,都有很好的借鉴意义。

沙门氏菌主要流行血清型耐药性的研究进展

引起人畜共患疾病的沙门氏菌已经对多种抗生素产生了抗性,相应的抗性基因通常位于基因盒、转座子、质粒或SGI-1和SGI-2基因岛的变体中。非伤寒沙门氏菌分离株引起人的感染主要是由于摄入受污染的食物,在美国、欧洲和中国的沙门氏菌主要流行血清型是肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌,而新出现的S.1,4,[5],12:i:-血清型的高耐药率引起世界范围的广泛关注。本文简述全世界范围内沙门氏菌的流行血清型的特征,并对沙门氏菌耐药性的发展趋势及其耐药性产生的分子机制进行综述。

雏鸡关节炎型沙门氏菌GZ2018株的分离鉴定

为雏鸡关节炎的防治提供参考,对贵州某肉鸡养殖场患病鸡进行病理解剖、分离培养、染色镜检、生化试验和16SrRNA基因序列分析等病原分离鉴定。结果表明:分离菌的培养特性、菌落形态特征、生理生化特征均与肠炎型沙门氏菌相同,并命名为GZ2018;分离菌对红霉素、头孢曲松、环丙沙星、丁胺卡那、氯霉素、庆大霉素和多黏霉素高度敏感;16SrRNA基因序列与肠炎型沙门氏菌的同源性在94.6%～100%;分离菌的遗传进化树与沙门氏菌属在同一分支,与中国分离株CQ0709(GenBank:FJ465088.1)在同一小分支上,属于鸡沙门氏菌。

滇西树鼩源沙门氏菌的分离鉴定及生物学特性研究

【目的】确定试验滇西树鼩患病致死的原因,分析分离菌株的致病性与耐药情况。【方法】本研究按常规平板划线法对发病死亡的滇西树鼩心脏血、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏进行病原菌分离,进一步对分离菌进行形态学观察、生化试验及16S rRNA基因鉴定,并进行药敏试验和致病性试验。【结果】从发病死亡的滇西树鼩肝脏和肺脏组织分离得到1株细菌。分离菌在麦康凯培养基上呈浅橘黄色单菌落,镜检为革兰氏阴性短杆菌。生化试验结果显示,分离菌能分解葡萄糖,不发酵乳糖,产气,产硫化氢等,符合沙门氏菌生化特性。遗传进化分析显示,分离株与肉用仔鸡源沙门氏菌CP082916菌株亲缘关系最近,16S rRNA基因核苷酸相似性为99%。药敏试验结果显示,分离菌对氯霉素、庆大霉素、新霉素、诺氟沙星等药物敏感;对克林霉素、万古霉素不敏感。致病性试验结果显示,该菌对树鼩及成年小鼠具有较强致病性,对小鼠的半数致死量(LD 50)为1.6×106 CFU。病理组织学观察显示,感染组树鼩和小鼠肺脏肺泡间隔增宽、间隔内可见炎性细胞浸润;肝脏细胞排列紊乱,见大量坏死细胞崩解,窦状隙变形或减小,中央静脉淤血,周围有炎性细胞浸润;脾脏部分细胞结构紊乱。【结论】沙门氏菌是引起这次试验滇西树鼩发病的致死原因,分离菌对氯霉素、庆大霉素、新霉素敏感,具有较强的致病性。