(S)-β-没药烯合酶N端截短对其功能的影响

【目的】探究(S)-β-没药烯合酶N端截短对其功能的影响。【方法】在截短处设计引物,引物引入限制性内切酶酶切位点,PCR产物经双酶切,连接到相应载体,经大肠杆菌Rosetta菌株表达,亲和层析纯化蛋白后蛋白酶切去融合标签,高分辨质谱测定蛋白分子量。体外催化产物经GC-FID/MS分析产物变化,Malachite Green无机磷酸含量法测定表观Kcat。【结果】截短10、20、30、40个氨基酸融合蛋白表达及纯化成功,GCFID分析结果表明去标签的不同长度截短的酶催化主产物均为没药烯,显示活性没有丧失;随着N端截短氨基酸数目的增多,表观Kcat稍有变化。截短60个氨基酸的融合蛋白His-N60表达成功,但亲和层析失败,取表达的上清蛋白体外催化,结果显示无倍半萜合酶活性。【结论】N端截短40个氨基酸不影响其产物特异性和活性。此结果和其他报道不一致,显示不同的倍半萜合酶N端的作用可能不同。