猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株ORF5基因的遗传变异分析

对来自河南省部分地区159份临床PRRS组织样品进行RT-PCR检测,并对阳性样品病毒ORF5扩增、测序和生物信息学分析。为河南省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)分子流行病学提供了数据支撑,对于针对性PRRS防控和研制疫苗具有一定的参考意义。

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株ORF5基因的克隆与变异分析

从河南郑州、新乡、周口不同地区猪场的急性病猪中分离到3株猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproduc-tive and respiratory syndrome virus,PRRSV),分别命名为PRRSV Hn-1/06、PRRSV Hn-2/06和PRRSV Hn-3/06,细胞中和试验证实其血清型与美洲型一致。利用RT-PCR方法克隆了它们的ORF5基因,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与7个不同来源的PRRSV毒株进行了同源性和亲缘关系比较分析,结果表明,3个分离株之间的ORF5基因及其推导的氨基酸均同源性均大于95.5%;与VR-2332标准北美洲株和疫苗株RespPRRS MLV间的同源性均低于与中国CH-1a毒株,而与流行的欧洲株间的同源性均低于54.5%。同时对推导氨基酸序列与6个北美洲型PRRSV株进行变异分析比较,证实其推导氨基酸序列发生了变异,特别是中和位点处第39位明显不同,表明河南省流行的PRRSV为北美洲型的变异株。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒河南分离株ORF3-7基因克隆与序列分析

参照GenBank中公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲株ATCC VR2332的ORF3～7基因序列,利用Pri mer软件分别设计合成了针对PRRSV ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的特异性引物,利用RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株分别扩增得到了大小约964、675、718、566和501 bp的片段,并将扩增的片段插入PGEM-T-easy载体进行测序。利用DNAStar软件进行序列分析表明,河南分离株Hn-1/06株属于美洲型,同时将Hn-1/06株ORF3～7基因的核苷酸序列和推导氨基酸序列与ATCC VR2332、LV、Resp、CH-1a、BJ-4、S1、CC-1、HB-1、JX0612、HUB1等分离株进行了同源性分析。

H9N2禽流感病毒河南分离株NS基因序列测定及进化生物信息分析

为明确河南地区鸡群中H9N2亚型AIV中非结构蛋白基因(NS)系统进化情况,对H9N2禽流感病毒河南分离毒株非结构蛋白基因(NS)进行扩增,并克隆到pGEM-T载体中测序,获得NS蛋白的完整编码序列。将NS核甘酸序列与GenBank已有的参考序列作比对,结果表明,河南分离毒株的NS基因与上海F98处于同一分支;在AIV NS基因系统发育进化树中,对测得的序列进行种系发育关系研究,确定H9N2禽流感病毒河南分离毒株的进化关系。

猪传染性胃肠炎病毒HN-2012分离株M基因遗传变异分析及其真核表达研究

以猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）HN-2012株的M基因为模板,设计了1对特异性引物,扩增了M基因,经克隆测序后,将该基因序列与NCBI中TGEV毒株的相应序列进行同源性分析,构建系统进化树并进行遗传变异分析。将M基因亚克隆至真核表达载体p CAGGS-M-flag中,转染293T细胞,利用flag标签抗体进行Western blot检测分析。结果表明,TGEV HN-2012株的M基因与其他毒株间核苷酸的同源性分别为94.8%~99.0%,与中国其他毒株关系较远。Western blot结果可见大小约为29.5 k D的目的条带,表明M基因成功的在293T细胞中表达。

猪TGEV HN-2012株ORF3a和ORF3b基因遗传变异分析及其真核表达研究

[目的] 研究猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）HN-2012株ORF3a和ORF3b基因的遗传变异情况。[方法] 根据GenBank公布的猪传染性胃肠炎病毒ORF3a和ORF3b基因序列,分别设计合成1对特异性引物,通过RTPCR从猪传染性胃肠炎病毒HN-2012株的cDNA中扩增ORF3a和ORF3b基因,经克隆测序后,将其基因序列与NCBI中不同来源的TGEV毒株的相应序列进行同源性分析,构建系统进化树并进行遗传变异分析,然后将ORF3a和ORF3b基因亚克隆至真核表达载体,构建pCAGGS-ORF3a-flag和pCAGGS-ORF3b-flag载体,转染293T细胞进行表达,利用flag标签抗体对2个基因的蛋白表达情况进行Western blot分析。[结果] TGEV HN-2012株的ORF3a基因与其他毒株间核苷酸的同源性为92.6%～100%,ORF3b基因与其他毒株间核苷酸的同源性为98.6%～99.7%。Western blot[结果]表明,ORF3a蛋白和ORF3b蛋白的分子质量约为8ku和28ku。[结论] TGEV HN-2012株的ORF3a基因与CH/JLY2/08、CH/HLJH/08株等亲缘关系较近,ORF3b基因与TS株、Miller M6株等亲缘关系较近,与我国其他毒株关系较远;成功实现了ORF3a和ORF3b蛋白在293T细胞中的表达。