甘蓝型油菜Kunitz蛋白酶抑制剂的异源表达与理化特征分析

利用毕赤酵母表达系统首次克隆表达了一个油菜籽来源的Kunitz蛋白酶抑制剂基因(RTI;rti),分离纯化后对该抑制剂进行了理化特征分析。结果显示:在摇瓶发酵水平,重组RTI诱导表达水平达到628 mg·L^(-1),抑制剂比活性达到69.6 TIU·mg^(-1)蛋白;重组RTI在30~90℃可保持70%以上抑制活性,在pH 2.0~11.0保持80%以上抑制活性;金属离子Cu^(2+)和Co^(2+),有机试剂甲醇、乙醇、丙酮和氯仿对其有抑制作用;重组RTI以非竞争性抑制方式与胰蛋白酶作用,对胰蛋白酶具有很强的、专一性抑制作用,属于典型的植物Kunitz型胰蛋白酶抑制剂。结合其良好的理化特性,重组RTI具有开发为抗虫蛋白的潜力。

Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的研究进展

Kunitz型胰蛋白酶抑制剂属于典型丝氨酸蛋白酶抑制剂,其生理功能至少包括了保护储存蛋白、调节内源蛋白酶的活性、保护个体免受昆虫和病原体的侵害、抑制癌细胞侵袭扩散、抗炎、抗真菌等作用。并已经应用到了抗虫性转基因植物和临床疾病治疗中。

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(SKTI)研究进展

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂 (SKTI)是一种典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂 ,主要集中在大豆的子叶中。近 60年来 ,对其生化特性及结构已有较多研究 ,通常认为这种蛋白酶抑制剂具有贮藏、调节内源蛋白酶活性及植物防御等作用。研究表明 ,这种蛋白酶抑制剂抗虫谱广 ,能显著抑制幼虫的生长发育不易产生抗性 ,对人畜无害 ,因此对其进行研究及开发利用具有重要的经济和社会效益。迄今为止 ,至少已有 4种基因被克隆 ,通过转基因技术在烟草、水稻、小麦等作物获得了抗性植株 .本文从SKTI的类型、基因克隆及生理功能等方面作一简单综述。

缺失Kunitz胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶2.3的大豆新品种——中黄16的选育

大豆新品种中黄 16 (原名中作 96 - 95 2 ) ,是中国农业科学院作物育种栽培研究所利用缺失Kunitz胰蛋白酶抑制剂的高产、优质、抗花叶病毒病 (SMV)的高代材料ti15 176作母本 ,美国引进优良品种Century近等基因系、脂肪氧化酶缺失的优质材料Century - 2 3作父本进行有性杂交 ,采用未变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Native PAGE)技术及等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳 (IEF PAGE)技术 ,对杂种后代胰蛋白酶抑制剂 (Ti)、脂肪氧化酶 (Lox)进行缺失检测及多年辅助选择育成。该品种于 1999～ 2 0 0 0年参加北京市夏播大豆区域试验 ,2 0 0 1年参加北京市夏播大豆生产试验 ,2 0 0 2年 4月通过北京市品种审定委员会审定。其突出特点是高产、稳产、优质 (蛋脂双高、蛋白质含量高且蛋白质品质优异———缺失Ti和Lox2 3)、抗花叶病毒病、综合性状优异。是国内第一个缺失Kunitz胰蛋白酶抑制且缺失脂肪氧化酶 2 3的三缺 (Lox 2 3,ti)优质大豆新品种。

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂新类型Tid的全序列分析

It was widely thought that 3 variants of Kunitz type trypsin inhibitor(SBTi A 2) existed in soybean seed storage protein.Three of codominant alleles Ti a,Ti b and Ti c were identified to decode these SBTi A 2 inhibitors and the amino acid sequences of them were determined,of which one or more different amino acid were found.Ti d was a new variant allele of SBTi A 2 discovered after analyzing more than 15 000 samples of soybean seed in China.In order to study the structure features of Ti d protein,the amino acid sequence of this protein was deduced from its coding region which was amplified by PCR from soybean genomic DNA and sequenced.By comparison with Ti a protein,two different amino acid residue were found between Ti a and Ti d proteins.One was an extra Ala inserted in the signal peptide of Ti d,with 8 residues from N terminal,and the other existed in the mature protein,with Glu 69 in Ti a protein turned into Lys 69 in Ti d protein.The amino acid sequence of Ti d mature protein was also different from those of Ti a and Ti b.

植物Kunitz蛋白酶抑制剂的生物信息学分析

运用生物信息学的方法,对已在GenBank数据库中注册的大豆、海红豆、凤凰木、象耳豆及洋紫荆等植物Kunitz蛋白酶抑制剂的氨基酸序列进行分析。结果显示,这些植物的Kunitz蛋白酶抑制剂中甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸、天冬氨酸及缬氨酸含量较丰富;不同植物Kunitz蛋白酶抑制剂的氨基酸序列具有较高的同源性,其中P1位点的氨基酸残基序度保守;分子进化研究表明Kunitz蛋白酶抑制剂可作为植物遗传分化和分子进化研究的重要依据;部分序列中存在信号肽;分子中不存在跨膜结构域,可能受蛋白激酶C的磷酸化;无规卷曲是多肽链中的主要结构元件;分子中包含典型的STI功能结构域。

多年生野生大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的克隆及分析

利用RT-PCR方法,从对蚜虫高抗的多年生野生大豆短绒野大豆(G.tomentella)(2n=78)未成熟子叶中扩增到了大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂同源基因单一目的片段,该基因和蛋白分别被命名为KTiPW54和KTiPW54。序列分析表明:该片段为654 bp的完整编码序列,编码218个氨基酸残基,编码的蛋白与栽培大豆(G.max)、野生大豆(G.soja)、短绒野大豆(G.tomentella)的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因编码蛋白高度保守的区域一致。将KTiPW54编码区克隆到表达载体pTWIN1,在宿主菌BL21(DE3)中经IPTG诱导获得高效表达。

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因RNAi载体的构建

采用PCR技术扩增得到胰蛋白酶抑制剂KTi基因正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GUS基因片段,将其分别连入克隆载体pMD18-TVector中。然后以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,通过AHLG作为中间载体,根据RNAi原理将组成RNAi结构的4个目的片段分别连入其中,成功构建了种子特异性RNAi表达载体p1301-KTiRi。研究结果为RNAi技术在大豆品质改良中的应用提供了基础。

日本囊对虾Kunitz型蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的表达纯化及活性分析

SKPI(shrimp Kunitz-type protease inhibitor)是日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)体内的一个小分子多肽,含有一个Kunitz型结构域,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂。目前已知丝氨酸蛋白酶抑制剂在节肢动物免疫系统中起着非常重要的作用,为了了解SKPI在对虾天然免疫系统中的作用,首先对其进行了重组表达。从日本囊对虾肝胰腺中扩增skpi的cDNA片段,插入改造后的pPIC9K酵母表达载体,获得的重组质粒转化至毕赤酵母GS115进行表达。由于改造的pPIC9K载体加入了6-His标签,因此利用Ni Sepharose High Performance对SKPI进行了高效纯化。初步的活性研究表明,重组表达的SKPI能特异性地抑制胰蛋白酶的水解活性。

Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失大豆新品系培育及其饲草价值分析

大豆作为饲料蛋白质的重要来源,既含有丰富的营养成分,也有影响蛋白质消化吸收的胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子。本研究以合丰50为母本,中黄16为父本,通过常规杂交育种及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子辅助育种技术,经过多年选育,获得适合黑龙江省栽培的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失稳定遗传的大豆新品系“HZ8009”。该品系生育期120 d,植株高大茎叶繁茂,无限结荚习性,籽粒蛋白质含量42%,脂肪含量20%。利用饲草质量检测技术对高代品系“HZ7009”植株饲草营养价值分析表明,与牡丹江秣食豆相比,“HZ7009”干草产量高21.39%,干物质中粗蛋白质含量高3.92%,且最佳刈割时期为花期至结荚期。大豆新品系“HZ8009”具有高蛋白、高生物量的特性,可作饲草资源品种加以广泛利用。

硝酸银诱导的大豆子叶中大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂的研究

采用二维电泳技术对硝酸银诱导的大豆子叶微粒体膜蛋白进行分离,利用四极杆-飞行时间串联质谱,对仅存在于诱导样品而不存在于对照样品中的蛋白质点进行氨基酸序列测定和分析,以期研究硝酸银处理对大豆子叶微粒体蛋白质的影响。结果显示:硝酸银可以诱导大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(SKTI)的产生,在诱导处理的子叶中大量存在其成熟形式,也存在其5 kDa小亚基,小亚基含有“GIGTIISSPER”和“FIAEGNPLR”氨基酸序列。该研究结果为SKTI的深入研究提供了实践依据,并为其分离纯化提供了简便途径,从而有利于对其更多性质的进一步研究。

Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构与功能研究

蛋白酶抑制剂在酶学及蛋白质的结构与功能关系研究中有重要意义,Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂是其中最重要的,也是研究最广泛的蛋白酶抑制剂之一.该类蛋白酶抑制剂三维结构高度保守:由一个明显的疏水核心、三对高度保守的二硫键桥、三链β 折叠和一个N端310螺旋及一个C端α 螺旋组成.3对二硫键对分子空间结构的稳定起着非常重要的作用.这一类型抑制剂有5个主要的活性位点:P1、P1′、P3、P3′、P4,它们都位于一个溶剂暴露的环上.P1位点是抑制作用的关键活性位点,抑制剂的专一性由P1位点氨基酸残基的性质决定;P1′位点氨基酸残基的侧链大小对抑制剂 酶的结合常数有很大影响,用大的侧链残基取代会导致结合常数降低;P4位点残基被取代经常产生负效应,会导致活性区域环的构象发生很大改变,从而影响酶与抑制剂的结合.

改性甲壳素固定化胰蛋白酶直接纯化牛肺Kunitz抑制剂的研究

通过对天然甲壳素 (或壳聚糖 )进行化学改性并修饰作为载体 ,再经氯代环氧丙烷活化偶联 ,制成固定化胰蛋白酶亲和吸附剂 (蛋白酶偶联率为 6 2 1% ,酶活性回收率为 5 7 8% ) ,直接亲和层析牛肺提取液中Kunitz抑制剂。纯化的产品每毫克蛋白酶抑制剂活力相当于 5 82 0BAEETTU/mg蛋白质 ,纯化率为 40 7。提高了Kunitz抑制剂的稳定性能和回收率 ,简化了工业化生产程序 。

大豆与蒺藜苜蓿Kunitz蛋白酶抑制剂的全基因组分析

Kunitz蛋白酶抑制剂(Kunitz protease inhibitor,KPI)基因是植物中具有抗逆功能的基因家族之一。为研究 KPI基因家族的进化与功能,对大豆和蒺藜苜蓿的KPI基因家族成员进行比较基因组学分析。利用生物信息学方法鉴定大豆与蒺藜苜蓿的KPI基因家族成员,并对其染色体定位进行分析,确定了大豆与蒺藜苜蓿KPI基因成员的直系同源与旁系同源基因及保守基序,并对大豆与蒺藜苜蓿不同组织及不同胁迫条件下KPI基因家族成员的表达情况进行了分析。结果显示,大豆、蒺藜苜蓿各含有48、46个KPI 基因成员,它们在染色体上分布不均匀,并存在串联重复而形成的基因簇;大豆与蒺藜苜蓿有11对直系同源基因,二者各有14对旁系同源基因;大豆和蒺藜苜蓿均含有3个结构基序,靠近N末端的2个结构基序为大豆与蒺藜苜蓿共有,而靠近C末端的第3个结构基序位置有较大差异,可以作为区分大豆与蒺藜苜蓿KPI成员的一段特征性标记;EST(Express sequence tags,表达序列标签)分析结果表明, KPI 基因家族成员主要在根、种子中表达;干旱与盐胁迫条件下, KPI成员的数量增加,推测KPI 参与了大豆与蒺藜苜蓿对干旱与盐胁迫的逆境响应过程。

山东产野生大豆胰蛋白酶抑制剂的初步研究

该实验建立了HPLC测定大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)活性的方法,并对山东产野生大豆(G.soja)与同地区产的黑豆和黄豆(G.max)的胰蛋白酶抑制活性差异进行了比较。用耦合了胰蛋白酶的亲合色谱柱对野生大豆的STI进行分离纯化,紫外分光光度法比较3种大豆的STI含量;PCR结合TA克隆技术对野生大豆STI中的Kunitz型(KSTI)蛋白基因编码区的氨基酸顺序进行初步测定。结果发现,山东产野生大豆的STI活性和含量均高于同地区产的黑豆和黄豆;山东产野生大豆的KSTI蛋白基因编码区的氨基酸顺序与已知的Tia型基本一致,仅第59位氨基酸由于单核苷酸的置换发生了Ser→Thr的转变,此位置位于活性中心附近。研究表明,山东产野生大豆胰蛋白酶抑制活性较强,且含量高。

缺失Kunitz胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶2的大豆新品种中黄31的选育

大豆新品种中黄31是中国农业科学院作物科学研究所利用缺失Kunitz胰蛋白酶抑制剂的高产、优质、抗花叶病毒病（SMV）的高代材料ti15176作母本。美国引进优良品种Century近等基因系、脂肪氧化酶缺失的优质材料Century-2．3作父本进行有性杂交，采用未变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native—PAGE）技术及等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF—PAGE）技术，对杂种后代胰蛋白酶抑制剂（Ti）、脂肪氧化酶（Lox）进行缺失检测及多年辅助选择育成。

定点突变对决明Kunitz抑制剂抑制活性的影响

【目的】决明Kunitz胰蛋白酶抑制剂1(Cassia obtusifolia Kunitz trypsin inhibitor 1,CoTI1)是一类具有β-三叶草结构的功能多肽,探究定点突变对其抑制活性的影响,对CoTI1的结构研究具有重要意义。【方法】基于CoTI1结构分析,分别将位于顶部盖子β2和β3折叠之间的Cys44,以及位于底部β-桶β9折叠内的Tyr134和Lys135这3个位点的氨基酸残基突变为丙氨酸(Ala),将各突变体进行蛋白表达之后再检测其对牛胰蛋白酶和菜青虫类胰蛋白酶的抑制作用。【结果】与野生型CoTI1相比,CoTI1^(C44D)对牛胰蛋白酶的抑制活性升高41.00%,CoTI1^(Y134D)和CoTI1^(K135D)对牛胰蛋白酶的抑制活性分别下降45.66%和36.73%;CoTI1^(C44D)、CoTI1^(Y134D)和CoTI1^(K135D)对菜青虫类胰蛋白酶的抑制活性分别下降46.94%、49.00%和38.11%。【结论】Cys44、Tyr134和Lys135参与了β-三叶草结构的形成,是稳定CoTI1的空间结构及抑制活性的重要残基,为CoTI1的结构研究奠定了重要的理论基础。

金环蛇蛇毒中的一种新型胰蛋白酶抑制剂(英文)

目的:从金环蛇蛇毒中分离纯化名为bungaruskunin 1的一种新型胰蛋白酶抑制剂,并从其毒腺的cDNA文库中克隆出该胰蛋白酶抑制剂的cDNA全序列。方法:通过Sephadex G-50,CM-Sephadex C-25,HPLC,RP-HPLC(C4 col-umn)方法分离纯化bungaruskunin 1。样品的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性则是在室温条件下50mmol·L-1Tris-HCl,pH7.8的缓冲液中通过对显色底物的水解抑制作用来检测的。金环蛇毒腺RNA用TRIZOL提取,并用SMARTM PCR cDNA syn-thesis kit(Clontech)建成cDNA文库。根据其信号肽的保守区域合成引物从该文库中扩增出bungaruskunin 1的cDNA全序列,进行胶回收,酶连到pMD18-T载体中转化测序。结果:bungaruskunin1的前体由83个氨基酸组成,其中信号肽含有24个氨基酸,成熟肽即:bungaruskunin 1含有59个氨基酸。bungaruskunin 1的cDNA序列与从红腹伊澳蛇Pseudechis porphy-riacus中分离纯化得到的丝氨酸蛋白酶抑制剂blackelin的cDNA序列的相似性高达64%。bungaruskunin 1是一种含有保守Kunitz端的Kuntiz蛋白酶抑制剂家族的一员,从而能够抑制蛋白酶和弹性酶的活性。在cDNA文库中,我们同时还筛选到了2种新的β-bungarotoxin B链的序列。结论:这些发现很好地证明了蛇中Kunitz/BPTI胰蛋白酶抑制剂和毒性神经的家族可能起源于共同的祖先。

食源性蛋白酶抑制剂结构与功能

食源性蛋白酶抑制剂(foodborne protease inhibitors,FPI)来源广泛,且种类繁多,研究分析这些FPI的特异性结构与其生理功能之间的关系具有十分重要的意义。该文首先综述蛋白酶抑制剂的来源、分类和作用机理;另外详细说明3种FPI(包括:Bowman-Birk型、Kunitz型以及Kazal型蛋白酶抑制剂等)命名的由来和其在结构上的区别,这些种类的FPI不仅可调节控制生物机体的蛋白质水解过程,同时还具有诸如调节机体防御、抗肿瘤、抗炎、抗凝血、预防肥胖等生理作用。