油菜黑胫病菌T-DNA插入诱变因素优化及突变体筛选

油菜黑胫病是由Leptosphaeria biglobosa引起的一种真菌病害。这种病害在我国油菜产区广泛发生,并造成一定的经济损失。为通过获取突变体来研究L.biglobosa的生态适应性机制及致病机制,本文优化了影响农杆菌介导转化(ATMT)油菜黑胫病菌L.biglobosa菌株Lb731的因素,评估转化子质量,并筛选相关突变体。结果明确了农杆菌介导转化菌株Lb731的最佳因素:潮霉素B浓度为50μg/mL,转化受体(分生孢子)培养时间为15 d(20℃),浓度为2×10^(7-8)孢子/mL,农杆菌-受体共培养温度为25℃,共培养时间为72 h。在最适条件下的转化效率达到80个转化子/百万分生孢子。T-DNA插入基因组的频率为100%,单拷贝插入频率为72.7%,转化子抗潮霉素性状能稳定遗传。从2136个转化子中获得了11个菌丝生长减缓突变体,7个色素产生缺陷突变体和14个分生孢子产生缺陷突变体,并从这些突变体中鉴定出7个致病力丧失突变体。采用hiTAIL-PCR技术,从3个突变体中获得了T-DNA插入位点侧翼序列。上述结果为深入研究L.biglobosa的生态适应性机制及致病机制提供了材料和线索。

农杆菌介导油菜黑胫病菌遗传转化

为优化建立农杆菌介导的油菜黑胫病菌遗传转化技术体系,以携带潮霉素磷酸转移酶基因的pCH-sGFP为载体,农杆菌LBA4404为介体,对油菜黑胫病菌的分生孢子进行转化。油菜黑胫病菌的最佳转化体系为:分生孢子浓度10^(6)个/mL,农杆菌OD600值0.6,乙酰丁香酮浓度200μmol/mL,pH 5.8,25℃,共培养4 d,获得120~161个转化子。随机选取26个转化子连续培养5代能够稳定遗传,绿色荧光蛋白基因gfp表达的菌丝和孢子可见绿色荧光。PCR鉴定发现T-DNA已整合进油菜黑胫病菌基因组中,Southern blot鉴定发现T-DNA以单拷贝的形式插入黑胫病菌中,转化子均能够稳定遗传。建立油菜黑胫病菌遗传转化体系为该病菌的致病机制研究和功能基因分析奠定了基础。

油菜茎基溃疡病菌与黑胫病菌菌丝的生长动态

比较了油菜茎基溃疡病菌（Leptosphaeria maculans）和油菜黑胫病菌（L.biglobosa）在不同培养温度和2种培养基上的菌丝生长动态。结果表明,在PDA和V8培养基平板上都生长良好,油菜茎基溃疡病菌培养温度在28℃时,油菜黑胫病菌培养温度在25℃或28℃时,在PDA平板上菌丝生长最好;油菜黑胫病菌与油菜茎基溃疡病菌菌落生长速度相比,在最适培养温度（25℃或28℃）和相同的培养时间（21 d）内,二者在PDA平板上的菌落生长速度分别为5~7 mm/d和2.0 mm/d,前者的菌落直径约90 mm,是后者的2倍。因此,在温度为25℃或28℃的条件下,PDA培养基最适合这2种病菌的生长。

甘肃省大白菜叶斑病菌分离鉴定及生物学特性测定

为明确引起甘肃省大白菜叶斑病的病原,对采自甘肃省陇南市武都区带有明显病斑症状的大白菜叶片采用组织分离法进行分离和致病性测定,结果表明菌株BCG为引起大白菜叶斑病的病原菌。其菌落圆形,中央菌丝褐色,周围菌丝白色绒毛状,分生孢子单细胞,壁光滑,透明,呈梭形或圆柱形;分生孢子器扁平,深褐色,大小204.20μm×140.88μm。利用ITS、Actin和β-tubulin基因序列分析表明,与油菜黑胫病菌(L.biglobosa)的相似性均达到了99%,且在系统发育树上聚在一起,结合形态特征将其鉴定为油菜黑胫病菌(L.biglobosa)。油菜黑胫病菌菌丝生长的最适培养基为PDA,最适生长温度为25℃,最适碳源为L-阿拉伯糖、L-鼠李糖和木糖,最适氮源为酵母浸粉;孢子萌发的最适温度为20℃,最适碳源为甘露醇,最适氮源为尿素;菌丝生长和孢子萌发的最适宜pH为6.0。该研究结果为国内首次报道由油菜黑胫病菌(L.biglobosa)引起大白菜叶斑病,为大白菜叶斑病的诊断和防治提供依据。

进境油菜籽中黑胫病菌和茎基溃疡病菌的检测

为准确鉴定从进境澳大利亚油菜籽样品中分离的真菌分离物,利用形态学特征、PCR检测、序列分析以及致病性测试等方法对分离物6382-43和6382-51进行了鉴定试验。结果表明,分离物6382-43的形态特征和油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans相似,菌丝生长较慢,菌落边缘不规则,不产生色素。油菜茎基溃疡病菌特异性引物LmacF/LmacR检测为PCR阳性;ITS区序列和油菜茎基溃疡病菌的序列相似性为99.8%;接种幼嫩油菜子叶产生油菜茎基溃疡病的典型症状。分离物6382-51的形态特征和油菜黑胫病菌L.biglobosa相似,菌丝生长较快,菌落边缘规则,产生色素;油菜黑胫病菌特异性引物LbigF/LmacR检测为PCR阳性;ITS区序列和油菜黑胫病菌的序列相似性为100%;接种幼嫩油菜子叶产生油菜黑胫病的典型症状。根据分离物的形态特征、PCR检测结果、序列分析以及致病性测试结果,将进境澳大利亚油菜籽样品中的真菌分离物6382-43和6382-51分别鉴定为油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans和油菜黑胫病菌L.biglobosa。