薏苡ClSAD、ClFAD2基因单倍型鉴定与相关脂肪酸关联分析

薏苡仁油是薏苡仁主要功能性物质之一,脂肪酸是其重要组成部分。以中国9个省份的190份薏苡种质为材料,检测其种仁硬脂酸、油酸、亚油酸含量,分析ClSAD、ClFAD2基因序列多态性并鉴定单倍型,进行脂肪酸含量单倍型关联分析。结果表明,不同薏苡种质种仁3种脂肪酸含量存在广泛变异,变异系数为15.84%~23.05%,遗传多样性指数为5.22~5.23,其中油酸含量最高,硬脂酸含量最低,各脂肪酸组分间呈极显著正相关。ClSAD和ClFAD2内部各有14个和3个SNP,分别鉴定到5个单倍型组合,ClSAD基因单倍型Hap3和ClFAD2基因单倍型Hap1分别与参考基因组一致。ClSAD基因单倍型Hap3与硬脂酸含量显著关联且具有负效应,利于硬脂酸向油酸转化。ClFAD2基因单倍型Hap1利于亚油酸的积累,而Hap2与亚油酸酸含量显著关联且具有负效应,不利于亚油酸的合成。在2个基因内部各鉴定到1个关键SNP位点,分别是形成SAD和FAD2酶活性差异的关键位点。研究结果将为高油薏苡优良品种的选育、分子标记开发和相关分子机制解析提供理论基础。

RNAi干扰油菜Δ^(12)-脂肪酸脱饱和酶基因的表达效果

为进一步研究RNA i介导的Δ12-脂肪酸脱饱和酶(FAD2)干扰基因对油菜内源FAD2基因表达的影响,以油菜肌动蛋白(-βActin)基因为内参照基因,提取转基因油菜幼嫩种子总RNA,通过半定量RT-PCR检测内源FAD2基因的相对表达量。结果表明,T1,T3代转基因种子中FAD2基因的相对表达量与对照相比明显降低。对T3代种子的油酸含量的分析表明,转基因油菜种子中油酸的含量比野生型增加了13.90到32.20个百分点,直接说明RNA i干扰体下调了FAD2基因的表达。因此,种子内源表达的FAD2基因被RNA i干扰体有效沉默,并且产生了能够稳定遗传两代的表型变化。

甘蓝型油菜Fad2基因的RNA干扰及无筛选标记高油酸含量转基因油菜新种质的获得

利用已获得的油菜种子贮存蛋白——十字花科蛋白(cruciferin)基因的启动子和终止子,构建了无选择标记基因且同时具有正义及反义结构的油酰去饱和酶基因(Fad2)种子特异表达RNAi载体,并通过农杆菌介导的转化,获得了只含有油菜原有基因且Fad2基因表达受抑制的转基因植株。RT-PCR分析结果表明,在油酸含量达到83.9%的转基因植株中未检测到在非转基因植株中普遍存在的Fad2基因转录mRNA——一种典型的RNA干扰现象。通过对植株生长发育状态的观察比较,该高油酸含量转基因株系并未表现出双突变体中由于Fad2基因的失活所引起的植株抗寒能力差、发育迟缓、花蕾死亡、结实率低等不利农艺学性状。

六个甘蓝型油菜油酸脱氢酶(FAD2)假基因的克隆和分析

以甘蓝型油菜湘油15为材料,采用PCR方法克隆并分析了56个FAD2基因克隆和47个FAD2基因cDNA克隆,从中发现6个新的FAD2拷贝。它们与公布的甘蓝型油菜FAD2基因(AY577313)具有87.0%以上的同源性,没有内含子,在开放阅读框中存在1～12个终止密码子,其中有2个拷贝具有转录功能。将这6个FAD2拷贝在酿酒酵母中进行体内表达实验,通过气相色谱检测脂肪酸组成证明其不具备油酸脱氢酶功能,与对照相比,也没有改变酵母体内脂肪酸组成。由此推测这6个FAD2拷贝为假基因。

花生FAD2基因RNAi载体转化及转基因籽粒脂肪酸分析

在构建了以花生△12脂肪酸去饱和酶(FAD2)基因自身启动子驱动、有内含子间隔的该基因编码序列反向重复片段的RNA干扰载体的基础上,对上述干扰载体进行了农杆菌介导的花生胚小叶的遗传转化,以期特异调控花生籽粒中油酸、亚油酸含量。在2个受体品种中获得105株抗性再生植株,用两对引物对其进行了PCR扩增,其中32株初步证实为转基因植株。采用近红外分析仪对转基因T1籽粒油酸和亚油酸含量的检测结果表明,转基因株系内油酸/亚油酸比值的变异高于对照,多数转基因株系油酸亚油酸比值平均数也显著高于对照。

甘蓝型油菜FAD2基因调控序列的克隆及瞬时表达分析

油酸去饱和酶FAD2(fatty acid desaturase2)是广泛存在于植物中的一种能催化油酸脱氢生成亚油酸的还原酶。根据GenBank上已知的甘蓝型油菜FAD2基因设计引物,以甘蓝型油菜(Brassica napusL.)叶片总DNA为模板,进行TAIL-PCR扩增,获得约1.4kb片段并测序。序列比对结果说明该片段为已知的FAD2基因编码区上游序列。将该片段进行不同长度的5′端缺失,并用缺失后的序列替换pBI221-LUC质粒上的CaMV35S启动子,构建了甘蓝型油菜瞬时表达载体,进行油菜原生质体瞬时表达的初步研究,结果表明该序列5′端-669bp至-1019bp对报告基因表达水平有较大的影响。结合启动子预测分析结果,此片段中可能存在的赤霉素应答元件、光调控元件等顺式作用元件对FAD2基因的表达调控具有重要作用。

油用向日葵脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1的克隆与表达分析

为了解FAD2-1基因在油用向日葵品质形成过程中的作用,以油用向日葵为材料,利用RT-PCR方法对高含油率保持系材料改HA89(含油率为46%)和低含油率保持系材料86-1(含油率为38%)的脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1进行克隆与表达分析。结果表明:获得了脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1全长cDNA编码序列,全长为1 137bp,编码378个氨基酸。核苷酸序列和蛋白序列比对结果表明,该基因在这2份材料中第44位和第102位核苷酸存在差异,并且都导致了氨基酸的改变。种子发育不同阶段油酸和亚油酸积累动态分析和qRT-PCR研究结果表明,FAD2-1基因表达量变化趋势与亚油酸含量变化趋势基本一致,而与油酸含量变化趋势基本相反。

两个油菜品系的fad2和sad基因序列差异比较

以来源相同而油酸含量差异显著的两个甘蓝型油菜DH品系WH141和WH149为研究材料克隆了与油酸含量相关的两个关键基因fad2(脂肪酸脱氢酶基因)和sad(硬脂酰ACP脱氢酶基因),并对克隆序列多次测序,利用DNAman软件分析两个基因序列差异。结果表明:①以fad2基因序列中的6个连续变异碱基为依据可将该基因分为2类,AF型和AY型。两者均存在于WH141和WH149品系中。AF型序列内两品系共有3处有义突变,但两品系对应氨基酸的出现频率有明显差异,说明相应fad2基因的拷贝数在两品系中有较大差异。另外,在氨基酸序列中第241位疏水氨基酸F变异为极性氨基酸Y,可能对该基因的功能有较大影响。AY型序列内,除了单碱基变异外,还存在小片段的插入缺失。单碱基变异大部分对应翻译不同种类的氨基酸。片段的插入缺失导致多个读码框出现,比较后发现WH141和WH149有3个相同的读码框,而且在WH149中发现还有2个可能的fad2基因特异表达框。②对比两品系sad基因的外显子序列后发现,WH141和WH149存在14个位点的单碱基变异,且绝大部分变异位点编码的氨基酸发生了改变。

CRISPR/Cas9编辑花生FAD2基因研究

油酸脱氢酶(Δ12FAD或FAD2)是催化油酸(OA)的C12位上脱氢生成双不饱和亚油酸(LA)的关键酶,它控制油酸、亚油酸的含量及其比值(O/L)。研究表明,AhFAD2是油酸生成亚油酸的关键基因,决定花生种子中油酸和亚油酸的相对含量。本研究根据AhFAD2基因序列,设计了相应sgRNA序列,并构建了旨在敲除FAD2A和FAD2B两个花生油酸脱氢酶的CRISPR/Cas9基因编辑载体。经花生基因转化后,通过对转基因花生突变位点基因组序列分析找出基因突变体。对靶基因分析发现,16株转基因花生含有29个FAD2A基因突变,其中16个突变引起蛋白质序列变化;11株转基因花生含有30个FAD2B基因突变,其中17个突变引起蛋白质序列变化。FAD2A和FAD2B蛋白质序列的变化可影响花生油酸脱氢酶的活性,改变油酸催化脱氢,使亚油酸合成受阻,油酸含量增加。本研究为研究花生脂肪酸合成及高油酸花生育种提供了宝贵的基因突变体材料。

不同油酸亚油酸比值花生品种油酸脱氢酶基因的时空表达特征

以不同油酸/亚油酸比值(O/L)花生品种为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对四个不同O/L花生品种不同组织中油酸脱氢酶基因(FAD2)的表达进行相对定量分析。结果表明:FAD2基因在不同O/L基因型中组成型表达,其在根、茎、叶中表达量低,在花中表达量最高,显著高于荚果等其它组织中的表达量,且品种间差异达显著水平;花U606和花U12在花、幼荚、成熟荚果中的表达量呈依次下降趋势;花育17和狮油红4号在花、幼荚、成熟荚果中的表达量则呈现高-低-次高的表达趋势,差异达显著水平。

中间锦鸡儿油酸脱氢酶基因的克隆与反义表达

高质量高得率的生物柴油要求植物脂肪酸拥有一个以上的双键,但数目尽可能要少,最好只有一个双键。但是现在绝大多数油料植物的多不饱和脂肪酸含量偏高,如中间锦鸡儿种子中多不饱和脂肪酸含量高达60%,迫切需要改良。以中间锦鸡儿枝、叶和种子为材料,根据Genbank中已登录的fad2基因同源序列,设计兼并性引物,利用PCR方法获得基因片段。在GenBank中Blast(GenBank登录号AY957 394),所得基因片段和同属豆科的Glycinemax Gm基因fad2-2a同源性达88%,属于fad2基因编码区中间片断。将所得片段经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI121,构建反义表达载体pBI121fad2,并利用农杆菌介导法转入烟草叶片,获得了抗卡那霉素和安苄青霉素的烟草再生植株。采用基因片段特异引物和表达载体pBI121上基因NPTⅡ引物双重检测均呈阳性的确认为烟草转基因植株,分别测定转基因烟草和对照种子脂肪酸。结果表明,与对照烟草比较,转基因烟草种子脂肪酸含量未见明显差异,而亚油酸减少了10.3%。研究结果为进一步进行柠条分子育种,获得高产单不饱和脂肪酸新品种及改造相关生物柴油用木本油料植物提供了科学依据。

油菜籽油酸合成相关基因研究进展

提高油酸含量是油菜品质育种的重要目标。简要介绍了脂肪酸的合成途径和与油菜种子中油酸合成与分解代谢相关的基因,对新技术和新方法与研究控制油酸基因的关系进行了探讨和展望。

油菜种子低亚油酸和亚麻酸含量异交稳定技术的建立

为降低油菜种子中的亚油酸和亚麻酸含量并使之在异交条件下保持基本稳定,以高油品种CY2作为受体亲本,采用RNA干涉技术沉默油菜内源Bn FAD2基因的表达,抑制油酸脱饱和反应。育成的3个独立转基因株系的亚油酸和亚麻酸含量下降到6%以下,其中亚油酸含量较受体亲本降低78.2%-86.5%,亚麻酸含量降低53.4%-65.8%。将3个转基因株系与2个亚油酸和亚麻酸含量较高的常规品种正反交,F1种子中这2种脂肪酸的含量依然保持在与转基因亲本相仿的低水平。由此可知,通过RNA干涉技术沉默Bn FAD2基因的表达可赋予油菜低亚油酸和亚麻酸含量的异交稳定特性。这一特性的获得对于今后培育异交稳定的高油酸油菜新品种具有重要意义。

棉花脂肪酸脱氢酶FAD2能够实现转基因小鼠n-6脂肪酸的内源性生物合成

脂肪酸脱氢酶FAD2(fatty acid desaturase-2)是一种将油酸(18:1)脱氢生成亚油酸(18:2n-6)的植物脱氢酶.在前期研究fad2转基因小鼠模型的基础上,本文新构建CMV promoter/fad2cDNA/SV40poly A真核表达载体,通过显微注射技术,生产出转基因小鼠.7只妊娠受体合计移植184枚受精卵,出生63只(34.2%)健康的成年小鼠.PCR和Southern blotting结果显示,有10只小鼠整合了外源基因,总的转基因效率是15.9%(10/63).随后,转基因小鼠与C57BL/6小鼠杂交选育,建立了10个转基因家系.最后,以6周龄的转基因后代同窝雌鼠作为样本(包括转基因阳性和阴性雌鼠),利用微量气相色谱方法,分析了腿部肌肉组织和肝脏组织的多种n-6脂肪酸的百分含量,结果显示,只有1个(10%)家系的转基因小鼠表达了外源基因,能够有效地改变目标脂肪酸的成分.其中肌肉组织中油酸百分含量(8.580±1.232)与野生型小鼠(10.812±1.244)没有区别(P≥0.05);但是,亚油酸的含量(15.653±0.557),明显(P<0.05)高于野生型小鼠(13.168±0.634),相对含量提高了19%;同时,下游的花生四烯酸(20:4n-6)的含量(12.850±1.479)也明显(P<0.01)高于野生型小鼠(6.871±0.665),相对含量更是提高了87%;转基因肝脏组织的亚油酸(15.962±0.552vs15.200±0.170)和花生四烯酸(12.607±0.623vs11.601±0.492)含量也明显高于野生型小鼠组织(P<0.05).本实验表明,植物fad2基因能够有效地促进转基因小鼠自身生物合成n-6脂肪酸.在国际上首次成功地建立了fad2转基因小鼠的表达模型,为相关疾病的研究奠定了基础.

CRISPR/Cas基因编辑技术及其在花生育种中的应用前景

随着生物技术和分子生物学的发展,基因编辑技术从锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)发展到应用更加简便有效的规律重复短回文序列簇(CRISPR)技术,目前正逐步应用于不同的作物育种中。本研究介绍了CRISPR基因编辑技术的基本结构和原理及其在油料作物上的初步应用,同时针对目前优质花生育种的需求,展望CRISPR技术在花生中的应用前景。