杆状病毒作为基因治疗载体的研究进展

杆状病毒是昆虫专一性的病原病毒 .近来的研究表明杆状病毒能进入哺乳动物细胞 ,但病毒自身不能在哺乳动物细胞中复制 ,感染也不引起细胞病变 .另外 ,已经证明杆状病毒能在体外或体内高效地转导许多类型哺乳动物细胞 ,并且能得到固定表达细胞系 ,显示了杆状病毒作为基因治疗载体有着良好的应用前景 .

缺氧诱导的肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定

目的检测本课题组已构建的缺氧诱导的hTERT基因启动子(5HRE-hTERTp)调控的基因表达载体调控元件的肿瘤特异性和对缺氧诱导的反应性。方法 MTT法检测不同浓度(100、200、300、400、500μmol/L)CoCl2对LoVo细胞活力以及增殖的影响。收集前期已包装成功的缺氧反应元件(hypoxia-response elements,HRE)和人端粒酶催化亚单位启动子hTERTp联合调控CDX2表达的慢病毒表达载体pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG(5HhC)病毒液,感染hTERT+LoVo细胞及hTERT-HK-2细胞,细胞免疫组化法验证该治疗载体的靶向性;复苏前期筛选的稳定表达5HhC的LoVo细胞(5HhC/LoVo),用缺氧模拟剂CoCl2模拟缺氧微环境,Western blot和RT-PCR分别检测缺氧调控下CDX2的表达水平。结果结肠癌细胞株LoVo在不同浓度CoCl2环境下随缺氧时间的延长,细胞活力及增殖均受到抑制,在高浓度(300、400、500μmol/L)作用下抑制效果更加明显;5HhC病毒成功感染hTERT+LoVo细胞,而在hTERT-HK-2细胞中不表达;Western blot和RT-PCR证实缺氧可上调5HhC/LoVo细胞中CDX2蛋白和mRNA的表达,且在300μmol/L CoCl2作用24h其蛋白表达量最高。结论缺氧微环境可明显上调hTERTp靶向性的治疗载体5HhC中抑癌基因CDX2的表达。

肝细胞特异性基因治疗载体的构建及活性研究

以细胞膜穿透肽 (Penetratin)基因为主要模板序列 ,融合肝细胞膜受体结合蛋白的DNA序列 ,设计一段肝细胞基因治疗载体的特异基因序列 ,构建并表达了肝细胞特异性载体体系及 3种对照体系。然后进行肝细胞的穿膜实验 ,细胞荧光显色结果提示肝细胞特异性载体体系可以有效地介导外源蛋白EGFP的基因进入肝细胞 ,并在肝细胞内表达。结论提示 ,所构建的载体体系有可能为肝细胞基因治疗提供一种新型的非病毒基因治疗载体。

非病毒基因治疗载体的研究进展

目的 介绍非病毒基因治疗载体的研究进展 ,为其深入研究提供参考。方法 对近年来有代表性的文献进行分析、归纳。结果 脂质体或脂质复合物、聚合物或复合载体等非病毒载体虽较为安全 ,但其不良反应近来也受到关注。非病毒载体的转染率还不够高 ,有效表达时间短 ,在体内的转运机制随给药途径的不同而不同。结论 为了进一步提高其转染率和表达持续时间 ,还须深入研究外源DNA进入靶细胞核的细胞和分子机制 ,并根据临床应用的实际个性化地设计安全。

基因治疗载体的研究进展

参考国内外相关文献,综合介绍逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关病毒载体、艾滋病病毒(HIV)载体和脂质体载体以及氧化铁磁性纳米颗粒等基因治疗载体的研究进展。

新型基因治疗载体——纳米羟基磷灰石

羟基磷灰石(Hydroxyapatite, Hap)是脊椎动物骨、牙中的天然组分,它具有优异的生物相容性和良好的生物降解性,是目前可通过化学调控大量合成无机生物材料,已被广泛用于硬组织修复材料、药物缓释载体材料等。本文详细综述了近年来纳米羟基磷灰石在基因治疗载体领域的研究进展,阐述了其用于基因治疗载体的转染机制、生物安全性、化学合成的可控性、可降解性及其靶向性等。

减毒鼠伤寒沙门氏菌作为肿瘤基因治疗载体的低毒性和靶向性研究

目的研究基因工程减毒的沙门氏菌VNP20009的低毒性和对于肿瘤细胞的靶向性。方法将野生型沙门氏菌（对照组）和VNP20009（研究组）分别通过尾静脉注射感染正常小鼠，观察其生存期差别；将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记VNP20009，红色荧光蛋白（red fluorescent protein，RFP）和GFP分别标记小鼠前胃癌细胞（mouse forestomach carcinoma cell，MFC）的胞质和胞核，尾静脉注射感染离体肿瘤细胞和荷瘤小鼠，以双色荧光成像的定性方法和组织匀浆细菌培养的定量方法显示细菌在离体肿瘤细胞、在体肿瘤和正常组织中的生长情况。结果接受野生型沙门氏菌注射的对照组小鼠在注射后4d全部死亡、而接受VNP20009注射的研究组小鼠在注射后10d依然全部存活；VNP20009能在离体肿瘤细胞中持续增殖并引起核碎裂；在体实验中，感染后第6天，正常组织中的细菌明显减少，到第18天时几乎消失，但在肿瘤组织中依然持续增殖。细菌在肿瘤／正常组织（肝脏）中的比例在感染后第4天约为224：1，第6天为1020：1。结论基因工程减毒的沙门氏菌VNP20009有着良好的低毒性以及肿瘤靶向性，具有作为肿瘤基因治疗载体的潜力。

壳聚糖作为基因治疗载体的研究

本文从壳聚糖-DNA复合物/微球的形成方法和机理、稳定性、转染细胞效率等方面综述了壳聚糖在基因治疗领域目前的研究现状。

外泌体作为靶向治疗载体的研究进展

外泌体是来源于细胞内膜的纳米级的囊泡,包含有核酸、蛋白和脂质等生命物质,作为一种细胞间交流的机制,在生命活动中发挥着重要作用。相对于脂质体载体,外泌体更稳定,生物相容性好,免疫原性低,而且可以渗透生物屏障,例如血脑屏障、胎盘屏障等。重点介绍外泌体载体靶向性的基础、外泌体载体装载负荷的方法及外泌体载体目前的应用进展和前景。

肝癌靶向基因治疗载体研究进展

目前对于肝癌治疗的研究已经进入分子水平,随着分子生物学的快速发展和基因工程技术的日臻成熟,肝癌的基因治疗已经迅速发展成为继手术切除、放化疗和介入治疗之后一个新的治疗模式。虽然已有许多将目的基因转入活细胞的方法,但仍存在转移效率不高、靶向性不高的问题。

热诱导肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定

目的检测已构建热反应元件修饰的端粒酶逆转录酶hTERT基因启动子(8HSEs-hTERTp)调控的基因表达载体肿瘤特异性和热诱导特性。方法①RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学检测细胞内hTERT mRNA和蛋白表达水平,选择hTERT高表达和低表达的细胞株作为该研究阳性细胞株和阴性细胞株;②收集前期已包装成功的热反应元件8HSEs和人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp联合调控自杀基因PNP表达的慢病毒表达载体8HhP病毒液,感染hTERT+SW480细胞及hTERT-MKN28细胞、hTERT-MRC-5细胞,细胞免疫荧光技术检测该治疗载体的肿瘤特异性及热反应特性;并用Western blot和RT-PCR分别检测热刺激条件下目的基因PNP在不同hTERT水平细胞株中的表达水平。结果 hTERT mRNA及蛋白在SW480细胞中高表达,在MKN28细胞和MRC-5细胞中低表达甚至阴性表达;免疫荧光、RT-PCR和Western blot结果显示,8HSEs-hTERTp调控的目的基因PNP只有在43℃处理下的SW480细胞中呈现高表达,而在阴性细胞株MKN28和MRC-5中PNP表达较少,而常温下SW480细胞中PNP的表达水平明显低于热处理组。结论 8HSEs修饰的hTERT启动子可以明显提高治疗载体的肿瘤特异性及热反应特性。

基于啮齿类衣壳蛋白的新基因治疗载体

目前,英国Royal Postgraduate Medical School的技术转移附属机构RPMS Technology公司正在请求在离体试验中很有希望的基因治疗载体的研究许可。该载体利用啮齿类病毒多瘤的主要衣壳蛋白(VP1)来转移DNA。 据研究人员声称,VP1假衣壳能在重组杆状病毒中产生并易于纯化。

环孢素A延长腺病毒基因治疗载体体内存在时间的研究

目的研究重组腺病毒载体在免疫抑制疗法应用中的安全性并探讨环孢素A对该载体在体内清除的影响。方法采取腹膜后注射纯化重组腺病毒建立动物模型,连续给予环孢素A 14 d,取不同时间点大鼠样本,HE染色观察各主要脏器病理反应,免疫组化方法检测肝、脾、肺、肾、肌肉及淋巴结腺病毒的表达情况。结果①HE染色切片,各脏器呈现一过性可逆性轻微炎性反应。②免疫组化检测,对照组中重组腺病毒逐渐减弱至阴性,实验组中重组腺病毒存在时相性明显延长(P<0.05)。③腺病毒分布呈现肝脾肺高表达而其它组织表达相对较低。结论重组腺病毒作为基因治疗载体在免疫抑制疗法应用中具有一定的安全性,环孢素A能够部分抑制实验动物体内的免疫反应从而延长重组腺病毒在体内存在的时间。

感染靶向性重组腺相关病毒载体在基因治疗中的研究进展

重组腺相关病毒(rAAV)是一种非常有希望的人体细胞基因治疗载体。它既可以转染分裂细胞又可以转染非分裂细胞。rAAV在宿主体内以定向整合的方式存在。AAV重组体在细胞内能长期稳定地表达,且在体内不引起明显的病理变化,然而它广泛的宿主范围是体内基因治疗的一个缺点,因为它不具备组织特异性或器官局限性转导能力从而难以增加其在基因治疗中的安全性和效率。因此,开发具有组织或器官靶向性的重组腺相关载体是腺相关病毒载体发展的方向。本文就近年来感染靶向性腺相关病毒在基因治疗中的进展作一综述。

骨髓间充质干细胞作为胰腺癌基因治疗载体的实验研究

目的:研究小鼠骨髓间充质干细胞对胰腺癌的聚集作用。方法:体外分离培养纯化绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞,通过Transwell共培养体系观察骨髓间充质干细胞向胰腺癌细胞PNAC-1的迁移;建立裸鼠胰腺癌移植瘤模型,经尾静脉回输骨髓间充质干细胞至荷瘤鼠体内,荧光显微镜动态观察肿瘤组织及其他脏器组织中骨髓间充质干细胞的分布及含量。结果:通过贴壁培养获得小鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测证实,CD44+CD45-、CD90+CD45-细胞均占细胞总数90%以上;Transwell共培养提示骨髓间充质干细胞向胰腺癌细胞PANC-1迁移,且随着肿瘤细胞数的增多,细胞迁移的数量增多(P<0.05);体内实验证实,骨髓间充质干细胞向胰腺癌组织特异性地靶向聚集,10 d内随着时间的延长骨髓间充质干细胞在胰腺癌组织中逐渐增多(P<0.05),10 d后增加不明显。结论:小鼠骨髓间充质干细胞体外向胰腺癌细胞迁移,体内向胰腺癌组织靶向聚集。

脑胶质瘤基因治疗载体的研究现状

脑胶质瘤因其浸润性生长、恶性程度高等特点,临床治疗效果差。在过去的20多年间,基因治疗作为治疗脑胶质瘤的一种新方式,已经成为研究热点。但是,因中枢神经系统解剖结构复杂以及血脑屏障的作用,使得核酸分子的递送成为一大难题。因此,迫切需要开发更加高效而安全的中枢神经系统递送载体,将目的基因转运至肿瘤细胞内而达到治疗的作用。本文主要就脑胶质瘤基因治疗载体的研究现状进行综述。