泌外病区耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌医院感染暴发调查与控制

目的研究某院泌外病区发生耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌医院感染暴发的原因。方法通过现场流行病学调查,对2016年8月7日~9月21日该院泌尿外科发生4例泌尿道耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌感染进行调查,对疑似污染环境和手术器械、相关物品进行微生物采样,对细菌培养结果进行微生物鉴定和药敏试验。结果共采集环境物表标本72份、内镜样本16份,一次性导尿管18份,均未见耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌,采取强化内镜清洗、灭菌流程、改用针对内镜生物膜的多酶洗液、减少内镜日周转频次等综合防控措施后,控制了疫情的蔓延。结论该院发生的泌尿道耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌感染暴发可能与内镜清洗,灭菌质量控制环节失控相关。

不同剂量芬太尼复合布比卡因腰麻对小儿泌外手术的影响

目的探索小儿泌外手术布比卡因腰麻的芬太尼最佳剂量。方法 ASAⅠ~Ⅱ级60例泌外手术的小儿患者。分为3组,A组加入芬太尼0.2μg/kg,B组加入芬太尼0.4μg/kg,C组加入芬太尼0.6μg/kg。记录3组患者围术期血流动力学变化,和麻醉后患者感觉和运动阻滞起效时间、最高阻滞平面、麻醉持续时间。手术后恶心、呕吐、瘙痒等不良反应。结果 3组患者年龄、体质量、手术时间、最高阻滞平面、感觉和运动阻滞起效时间无明显差异。B组和C组麻醉持续时间较A组长（P〈0.05）。术后镇痛药需要量C组较B组和A组少（P〈0.05）,B组较A组少（P〈0.05）。C组瘙痒发生率较B、A组高。血压动力学变化各组之间无明显差异。结论 0.4~6μg/kg芬太尼复合布比卡因腰麻用于小儿泌外手术其阻滞时间延长,6μg/kg芬太尼复合布比卡因腰麻瘙痒发生率稍增加。

改良APACHEⅡ评分预测泌外急诊手术病人术后并发症的价值

目的探讨改良急性生理和慢性健康状态评价系统Ⅱ(APACHEⅡ)对泌尿外科急诊手术病人术后并发症进行评估的应用价值。方法回顾性分析137例泌尿外科急诊手术病人术后并发症情况,用改良APACHEⅡ评分系统(将A记分中的年龄改为手术持续时间,将B记分中的有严重器官功能不全或免疫损害改为腹腔污染与术中失血量。作为手术侵袭度)进行评分,并按Copeland并发症发生率计算公式,比较实际并发症发病人数与预测发病人数。结果有并发症组26例,男23例,女3例,平均住院时间(31.6±3.8)天。手术侵袭度评分(15.5±4.6),急性生理评分(21.3±3.7)。无并发症组81例,男76例,女5例,平均住院时间(16.3±5.3)天。手术侵袭度评分(11.3±3.6),急性生理评分(15.1±3.2)。两组比较差别均有显著性意义(P<0.05)。按Copeland公式预测并发症人数31例,实际发生并发症人数26例,差别无显著意义(P<0.05)。结论将APACHEⅡ评分系统中的A记分与B记分改良为手术侵袭度后,对预测泌尿外科急诊手术病人术后并发症的发生有价值。

宫颈癌细胞分泌外泌体介导上皮-间质转化提高癌前细胞侵袭能力的体外研究

目的:研究宫颈癌细胞Siha分泌的外泌体(Exosomes)能否介导上皮-间质转化(EMT),从而改变癌前细胞Ect1的体外侵袭能力。方法:差速超速离心法分离SihaExo,透射电镜观察形态,Western blot检测标志蛋白表达,共聚焦显微镜观察PKH67染色外泌体的生物学活性。Siha-Exo和PBS分别与Ect1共培养48h后Western blot检测上皮和间质转化标志蛋白的表达,Transwell侵袭实验检测共培养后Ect1体外侵袭能力。结果:Siha-Exo为直径30~100nm的盘状囊泡,特异性表达标志性蛋白CD63和CD81,能够被受体细胞Ect1内吞,具备生物学活性。Western blot结果显示,与PBS组相比,Siha-Exo组下调Ect1细胞中上皮标志蛋白E-Cadherin和β-Catenin的表达,上调间质标志蛋白NCadherin和Vimentin的表达。Transwell侵袭实验显示,与PBS组相比,Siha-Exo组穿透聚碳酯膜的Ect1细胞数明显增多(P=0.01)。结论:Siha-Exo能够介导Ect1发生EMT变化,提高其体外侵袭能力。

干扰素γ刺激hUC-MSCs分泌外泌体促进调节性T细胞生成

目的探讨生理和炎性微环境下人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UCMSCs)能否通过外泌体诱导调节性T细胞的生成来发挥免疫抑制功能。方法胶原酶消化法分离h UC-MSCs,应用流式细胞术鉴定h UC-MSCs。IFN-γ模拟体内炎性微环境,以未预处理为对照,分别提取外泌体,得到Nor-h UC-exo和IFN-γ-stimulated h UC-exo,分析其浓度及粒径分布等特征、并鉴定表面标记蛋白CD63的表达。采用h UC-MSCs、Nor-h UCexo、IFN-γpretreated-h UC-MSCs、IFN-γstimulated h UC-exo与人外周血单个核细胞共培养5 d后,流式细胞术检测T细胞的增殖、调节性T细胞的比例变化。结果 h UC-MSCs高表达CD73、CD44等间充质干细胞标志物。IFN-γ刺激前后外泌体粒径无明显变化,但IFN-γ刺激后分泌量和CD63增加(P<0.05)。CFSE染料示踪结果显示,h UC-MSCs来源的外泌体抑制PBMCs增殖(P<0.01),且IFN-γ刺激后明显提高外泌体的免疫抑制能力(P<0.01)。在活化T细胞中,IFN-γ-stimulated h UC-exo组Treg比例(11.53±0.88%)与IFN-γpretreated-h UC-MSCs组(7.54±0.50%)(P<0.05)、Norh UC-exo组(6.60±0.56%)(P<0.01)、对照组(3.87±0.73%)(P<0.01)相比升高。结论 h UC-MSCs可通过分泌外泌体来发挥免疫调节作用,在炎症因子刺激下h UCMSCs分泌的外泌体明显促进调节性T细胞的生成,h UC-exo可能是潜在的免疫抑制载体。

过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞通过分泌外泌体增强其抗凋亡能力的研究

目的探讨过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)是否通过分泌外泌体(Exosome)增强其细胞抗凋亡能力,进而提高心肌梗死后心功能。方法 2017年1—12月选取健康4周龄SPF级C57BL/6小鼠45只,通过慢病毒载体GV308携带GATA-4转染小鼠BMSCs构建过表达GATA-4小鼠BMSCs并加入基因开启剂强力霉素(DOX),而后采用Exo Quick-TC提取BMSCs分泌的Exosome,并检测Exosome纯度、电镜下观察其形态。体外实验:与过表达GATA-4 BMSCs分泌的Exosome共同培养的心肌细胞为A组(体外),与空载体BMSCs分泌的Exosome共同培养的心肌细胞为B组(体外),与BMSCs分泌的Exosome共同培养的心肌细胞为C组(体外),低氧(1%)无血清条件下培养的心肌细胞为D组(体外),正常条件下单独培养的心肌细胞为E组(体外),各组均培养48 h,后采用流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡率,采用Western blotting法检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、细胞色素C表达水平。体内实验:选取12只小鼠建立心机梗死模型,造模成功48 h后经尾静脉注射80 000μg的Exosome,其中A组(体内)注射过表达GATA-4 BMSCs分泌的Exosome,B组(体内)注射空载体BMSCs分泌的Exosome,C组(体内)注射BMSCs分泌的Exosome,另取3只心肌梗死未处理小鼠作为D组(体内),3只正常小鼠作为E组(体内)。于注射Exosome后48 h采用心脏超声仪(PHILIPS EPIQ 7C)评估各组小鼠心功能。完成心脏彩超后采用原位免疫组化法评估心肌梗死小鼠心脏凋亡细胞数量。结果 Exosome表达量为0.272 5,Exosome纯度为5.25×108个,电镜可见Exosome大小40~100 nm。A组(体外)细胞凋亡率低于B组(体外)、C组(体外)、D组(体外),但高于E组(体外)(P<0.05)。A组(体外)Caspase 8、细胞色素C表达水平低于B组(体外)、C组(体外)、D组(体外)及E组(体外)(P<0.05)。A组(体内)小鼠射血分数(EF)、环比收缩(FS)前后差值高于B组(体内)、C组(体内)、D组(体内)及E组(体内)(P<0.05)。A组(体内)小鼠心肌细胞凋亡细胞数量高于E组(体内),而低于B组(体内)、C组(体内)、D组(体内)(P<0.05)。结论过表达GATA-4 BMSCs分泌的Exosome可以通过增强BMSCs抗凋亡能力,进而有效改善心肌梗死后小鼠的心功能。

不同状态p53小鼠骨髓间质干细胞分泌外泌体的差异

目的:比较3种p53状态(p53^(+/+)、p53^(+/-)和p53^(-/-))的小鼠骨髓间质干细胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cells,m BMMSC)分泌的外泌体(exosome)是否存在差异。方法:采用透射电镜及蛋白质印迹鉴定和分析p53不同状态m BMMSC分泌的外泌体的形态及膜表面特异性标志蛋白CD9和CD63,采用Nanosight纳米颗粒跟踪分析仪比较外泌体浓度和大小的差异。结果:3种m BMMSC分泌的外泌体均为圆形或椭圆形的膜性囊泡,直径均在100 nm左右。p53^(-/-)m BMMSC和p53^(+/-)m BMMSC分泌的外泌体浓度明显高于p53^(+/+)m BMMSC,p53^(-/-)m BMMSC与p53^(+/-)m BMMSC分泌的外泌体浓度无显著性差异。3种细胞来源的外泌体均表达膜表面特异性标志蛋白CD9、CD63。结论:p53缺失的m BMMSC能分泌更多的外泌体。

人参皂苷Rg1调控内皮祖细胞分泌外泌体及表达血管新生相关miRNAs的影响

目的探讨人参皂苷Rg1(Ginsenoside-Rg1,G-Rg1)对内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)分泌外泌体(Endothelial progenitor cells derived exosomes,EPC-Exos)及表达血管新生相关微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)的影响,为进一步研究G-Rg1介导的EPC-Exos促血管新生的作用机制奠定基础。方法无菌条件下取正常剖宫产胎盘中的脐带血,分离得到单个核细胞,置于EGM-2培养基传代培养至P3代,通过CD31免疫磁珠分选法及双荧光染色法共同鉴定细胞。将鉴定成功的EPCs随机分为实验组及对照组,实验组用40mg·L^(-1)G-Rg1干预,对照组用等体积PBS液处理,各培养24h。采用超速离心法结合超滤法提取EPC-Exos,通过透射电子显微镜观察其形态,蛋白印迹法鉴定其特征性表面标志物,BCA蛋白定量法检测总蛋白浓度,RT-qPCR法检测各组外泌体中与血管新生相关miRNAs分子的表达。结果培养24h后,各组EPC-Exos表面标志物CD9、CD63和TSG101的表达均呈阳性。对照组与实验组EPC-Exos总蛋白浓度分别为(0.85±0.02)和(0.97±0.02)ug·uL^(-1),差异显著,有统计学意义(P<0.01)。实验组中部分促血管新生相关miRNAs表达较对照组增多,即miRNA-126-5p、miRNA-146a-5p、miRNA-210、miRNA-214-5p的表达明显增多,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。结论人参皂苷(G-Rg1)能促进内皮祖细胞分泌外泌体,使外泌体中与血管新生相关的miRNA-126-5p、miRNA-146a-5p、miRNA-210、miRNA-214-5p表达明显增多,可进一步从外泌体水平阐释G-Rg1促进血管新生的机制。

CSE诱导支气管上皮细胞分泌外泌体miR-186促进肺成纤维细胞增殖

目的:研究香烟提取物(cigarette smoke extract,CSE)对支气管上皮细胞16HBE外泌体miR-186表达量的影响,以及16HBE来源的外泌体miR-186对肺成纤维细胞增殖的影响。方法:收集CSE处理的16HBE细胞上清中外泌体miR-186,用于MRC-5细胞培养;使用qPCR检测外泌体miR-186的表达;使用CCK-8检测MRC-5细胞增殖能力;使用双荧光素酶验证miR-186与Bcl2L11基因的靶向结合,使用Western blot检测Bcl2L11的表达。结果:透射电镜观察到16HBE细胞上清外泌体直径约100 nm的球形结构形态;CSE处理明显促进外泌体miR-186的表达;CSE诱导的外泌体miR-186能促进MRC-5细胞增殖;miR-186与Bcl2L11存在靶向结合关系;miR-186 mimic明显抑制了Bcl2L11的表达。结论:CSE诱导的16HBE细胞外泌体miR-186通过靶向结合Bcl2L11基因,在成纤维细胞增殖中起到重要作用。

宫颈癌细胞分泌外泌体对宫颈癌细胞增殖、凋亡功能及MAPK/ERK信号通路的影响

目的探讨宫颈癌细胞分泌外泌体对宫颈癌细胞增殖、凋亡功能及丝裂原活化蛋白激酶/胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路的影响。方法采用超速离心法分离宫颈癌C33A细胞外泌体。将C33A细胞分为外泌体(Exo)组和对照(C)组,Exo组C33A细胞用含外泌体的培养基培养,C组C33A细胞用不含外泌体的培养基培养。MTT测定C33A细胞增殖能力,克隆形成实验测定C33A细胞集落形成能力,流式细胞术测定C33A细胞凋亡能力,Western印迹测定C33A细胞中ERK1/2、磷酸化(p)ERK1/2蛋白水平。结果1 d、3 d、5 d,Exo组C33A细胞A值明显高于C组(P<0.05),Exo组C33A细胞集落形成数明显高于C组(P<0.05),Exo组C33A细胞凋亡率明显低于C组(P<0.05),两组C33A细胞ERK1/2蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05);Exo组C33A细胞p-ERK1/2蛋白水平明显高于C组(P<0.05)。结论宫颈癌C33A细胞来源外泌体可促进C33A细胞增殖、抑制其凋亡,其机制可能与C33A细胞外泌体可激活MAPK/ERK信号通路有关。

过表达心肌细胞转录因子骨髓间充质干细胞分泌外泌体抗心肌细胞凋亡的分子调控机制

目的过表达心肌细胞转录因子(GATA-4)的小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分泌的外泌体(BMSC^ATA-4-exosome )可能是修复心肌损伤的关键分子,文章探讨过表达GATA-4小鼠BMSC分泌外泌体(BMSC^ATA-4exosome)抑制心肌细胞凋亡的分子调控网络。方法在过表达GATA-4小鼠BMSC培养体系内加入miR-330-3p模拟剂(miR-330-3p-mimic)提取分泌的exosome与心肌细胞在低氧无血清条件下培养24h作为实验组(过表达miR-330-3p组),将过表达GATA-4组、空载体组、BMSC组作为混杂因素对照,同时将在低氧无血清条件下单独培养24h的心肌细胞及在正常条件下单独培养24h的心肌细胞作为阳性及阴性对照组。采用流式细胞技术检测各组心肌细胞的凋亡率。采用RT-PCR检测各组心肌细胞内miR-330-3p的表达量。并根据microRNA靶基因预测结果采用Western blot检测miR-330-3p对应靶基因Ap2m1及Cnot4转录蛋白表达。结果超过90%小鼠的BMSC表达CD29(表达率为99.71%)、CD44(表达率为97.28%)和SCA-1(表达率为99.4%),仅0.1%的细胞表达CD11b。过表达miR-330-3p组心肌细胞早期凋亡率[(7.90±0.34)%]较阴性对照组[(2.30±0.09)%]高,但较阳性对照组[(51.48±0.40)%]、BMSC组[(18.32±3.03)%]、空载体组[(16.99±2.93)%]、过表达GATA-4组[(10.22±0.35)%]明显降低(P<0.05)。过表达miR-330-3p组心肌细胞内的miR-330-3p的表达[(396.10±1.02)%]较阴性对照组[(1.37±0.33)%]、阳性对照组[(0.26±0.32)%]、BMSC组[(1.40±0.42)%]、空载体组[(1.41±0.27)%]、过表达GATA-4组[(3.80±0.62)%]明显增高(P<0.05)。过表达miR-330-3p组心肌细胞内Ap2m1、 Cont4的表达较阴性对照组、阳性对照组、BMSC组、空载体组、过表达GATA-4组明显下降(P<0.05)。结论过表达GATA-4的BMSCs分泌的外泌体通过miR-330-3p抑制Ap2m1蛋白表达抗心肌细胞凋亡。

过表达IDO骨髓间充质干细胞分泌外泌体改善移植心脏存活

目的探讨过表达吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)通过分泌外泌体(exosome)改善大鼠腹腔异位移植心脏存活机制。方法构建过表达IDO大鼠骨髓间充质干细胞,而后提取分泌的exosome。同时建立大鼠腹腔异位移植心脏模型,经尾静脉给予相应细胞分泌的exosome后检测如下指标:移植心脏心功能变化;移植心脏局部荧光强度;受体大鼠脾脏细胞表面CD40、CD86、CD80、主要组织相容性抗原-Ⅱ(MHCⅡ)、CD274(PDL-1)、CD45RA、CD45RA+CD45RB表达及Treg细胞数量。并采用苏木精-伊红(HE)染色评估移植心脏局部炎性细胞浸润情况。结果 (1)大鼠异位心脏移植模型建立后,给予相应细胞分泌exosome,过表达IDO-BMSCs-exosome组移植心脏的射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)较其余各组有提高;(2)过表达IDO-BMSCs-exosome组移植心脏局部Dir荧光最强;(3)采用流式细胞技术证实过表达IDO-BMSCs-exosome组受体脾细胞CD86、CD40、CD80、主要组织相容性抗原-Ⅱ(MHCⅡ)、CD45RA+CD45RB、CD45RA、OX62表达量下降,而CD274(PDL-1)表达增高同时Treg细胞数量较其他组增多;(4)HE染色证实过表达IDO-BMSCs-exosome组移植心脏局部有较少炎性细胞浸润。结论大鼠BMSCs分泌的exosome可以有效调节DC细胞表面抗原分子表达、促进Treg细胞增生,从而在多个免疫层面改善心脏移植排斥。

卵巢上皮癌细胞SKOV3通过分泌外泌体促进单核巨噬细胞分化为肿瘤相关巨噬细胞的研究

目的：研究上皮性卵巢癌细胞SKOV3分泌的外泌体（exosomes）能否调控单核巨噬细胞分化为M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）,并进一步参与肿瘤的转移。方法：分离SKOV3细胞外泌体,透射电镜观察形态。卵巢癌细胞外泌体、M-CSF＋IL-4和空培养基分别与人外周血CD14＋单核细胞共培养3天,观察细胞形态。结晶紫计数单核细胞贴壁率;流式细胞仪检测共培养后单核细胞CD206、HLA-DR的表达情况;ELISA法检测共培养后上清中IL-10和IL-12的含量;体外迁移实验检测肿瘤细胞迁移能力的变化。结果：透射电镜显示,外泌体近似圆形,直径30~80nm。结晶紫计数显示,外泌体共培养组和M-CSF＋IL-4组的OD值（分别为0.13±0.06,0.16±0.04）较空培养基组（0.04±0.01）增加,差异有统计学意义（P〈0.05）。倒置显微镜发现,细胞贴壁,形态类似巨噬细胞。流式结果显示,外泌体共培养组和M-CSF＋IL-4组的单核细胞CD206（分别为71.86±5.62、99.27±0.32）表达水平升高,HLA-DR（分别为12.71±7.22、3.55±0.27）表达水平降低,与空培养基组比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。ELISA检测结果显示,外泌体共培养组和M-CSF＋IL-4组的上清IL-10含量（分别为71.72±0.81、82.13±2.11）增加,IL-12含量（分别为34.88±4.75、19.71±4.28）减少,与空培养基组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。体外迁移实验显示,外泌体刺激单核细胞上清组的肿瘤细胞迁移数（121.58±2.25）明显增加,分别与空培养基对照组、单核细胞上清组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：卵巢上皮癌细胞SKOV3的外泌体可诱导单核巨噬细胞分化极化为卵巢癌腹膜内TAMs表型,从而促进卵巢癌细胞的迁移能力。

肝癌细胞自分泌外泌体通过TGF-β1调控自身细胞学行为

目的:研究肝癌Huh7细胞外泌体促进自身转移的机制。方法:培养肝癌Huh7细胞,分离提取外泌体并进行鉴定。将分离的外泌体与Huh7细胞共培养,Transwell比较细胞迁移和侵袭能力;检测外泌体中TGF-β1水平;实时荧光定量PCR和Western blot分别检测TGF-β1、SMAD2/3、EMT相关分子表达。结果:提取的外泌体经Western blot检出CD63、TSG101条带;透射电镜检测出双侧膜结构小体;纳米粒径分析显示颗粒大小集中在100 nm左右。外泌体中检出TGF-β1。外泌体与Huh7细胞共培养,免疫荧光显示外泌体成功进入Huh7细胞。与对照组相比,共培养组细胞迁移和侵袭大幅增加,TGF-β/Smad通路相关分子活化,上皮标志物E-钙黏蛋白、p-Smad7表达下降,间充质标志物-波形蛋白表达升高。结论:肝癌Huh7细胞自分泌的外泌体通过运输TGF-β1上调TGF/Smad通路进而影响肝癌转移,探明了肝癌发展机制,为肝细胞癌治疗提供了新思路。

CD4^+ CD25^+ Treg细胞分泌外泌体在疾病中作用的研究进展

调节性T细胞为T细胞的一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群,在维持机体的免疫耐受以及调控免疫应答中起重要作用。外泌体是细胞分泌的异质性纳米级胞外囊泡。现在研究认为外泌体在细胞间通讯中发挥重要作用,外泌体可将其细胞内的多种RNA、DNA片段、脂质和蛋白质等物质转送到不同的受体细胞,从而改变受体细胞的生物学活性。多项研究证据表明Treg细胞可分泌外泌体发挥免疫调节作用,并参与感染免疫、器官移植、超敏反应、自身免疫病以及肿瘤的发生与发展。本文对Treg细胞来源外泌体的组成成分、形成途径以及其免疫调节作用等进行综述。

肺癌干细胞分泌外泌体增强肺癌细胞对化疗敏感性的研究

目的研究化疗药物诱导后肺癌干细胞分泌外泌体(Exosomes)对肺癌细胞化疗敏感性的影响。方法采用流式荧光细胞分选技术从人肺癌细胞系A549中分离出肺癌干细胞,采用1μmol/L吉非替尼培养液诱导肺癌干细胞分泌外泌体并提取。将外泌体作用于人肺癌细胞系A549,噻唑蓝(MTT)法检测干预前后肺癌细胞的增殖能力和对化疗药物的敏感程度。Western blot检测细胞耐药相关蛋白表达水平。结果采用超速离心方法能提取化疗药物诱导后肺癌干细胞分泌的外泌体;MTT法显示这类外泌体能够促进人肺癌细胞系A549的增殖,导致人肺癌细胞系A549对吉非替尼的IC_(50)值明显增大(P<0.05)。化疗药物诱导后肺癌干细胞分泌外泌体能增强肺癌细胞MDR-1、ABCG2和LRR耐药相关蛋白的表达。结论化疗药物诱导后肺癌干细胞来源的外泌体能增强肺癌细胞增殖活性,并诱导肺癌细胞对化疗药物的耐药。

过表达IDO骨髓间充质干细胞分泌外泌体通过不同分子轴调节DC及T细胞

目的探讨过表达吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)间充质干细胞分泌外泌体(BMSC^(IDO)-exosome)抑制T及DC细胞激活机制。方法将BMSC^(IDO)-exosome与DC、T细胞共培养设立为实验组。检测共培养DC及T细胞内miR-540-3p、CD74、CD28、CCL4、p-ERK1/2、p-NF-κB、p-AKT表达。验证miRNA-540-3p与CD74基因的靶向结合。结果实验组中DC细胞内miR-540-3p表达增高,CD74、p-p65表达降低。T细胞内miR-540-3p表达增高,CD74、p-AKT表达降低。miRNA-540-3p与CD74可以靶向结合。结论BMSC^(IDO)-exosome通过miRNA-540-3p(+)/CD74(-)/p-NF-κB分子轴抑制DC细胞的激活。通过miRNA-540-3p(+)/CD74(-)/p-AKT(-)分子轴抑制T细胞的激活。

人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体特性研究

本研究旨在探讨正常人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSC)分泌的外泌体(exosome)免疫调节功能及支持血管形成能力。收集第4-6代BMMSC上清液提取外泌体,应用透射电镜观察其形态,蛋白印迹法检测其表面特异标志CD9,bicinchoninic acid(BCA)方法定量检测外泌体分泌量;与正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNC)作用72 h后用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测PBMNC分泌的γ-干扰素(IFN-γ);实时定量PCR检测外泌体内免疫相关microRNA表达;共聚焦显微镜观察外泌体与人脐带静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的作用方式,与HUVEC共培养后观察其网状结构形成;应用裸鼠体内试验检测外泌体对血管形成能力的作用。结果表明,正常人骨髓间充质干细胞分泌的外泌体近似圆形,直径在40-160 nm之间,表达表面标志CD9,其分泌量与接种细胞数呈线性关系,可抑制PBMNC分泌IFN-γ(P<0.01),内含有免疫相关microRNA如miR301、miR22和miR-let-7a等,能促进HUVEC网状结构形成和血管形成(P<0.01)。结论:BMMSC分泌外泌体具有免疫调节功能与支持血管形成作用。

过表达IDO的骨髓间充质干细胞分泌外泌体下调树突状细胞免疫促进分子表达和上调Treg细胞数量

目的探讨过表达吲哚胺2, 3-双加氧酶(indoleamine 2, 3-dioxy genase, IDO)大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchy mal stem cells, BMSCs))分泌外泌体(exosome, ES)的免疫抑制调节作用。方法构建过表达IDO大鼠骨髓间充质干细胞提取分泌的外泌体做为实验组,将空载体大鼠骨髓间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞分泌的外泌体做为对照组,将实验组及对照组分泌的外泌体分别与树突状细胞(DC细胞)、T细胞体外共培养48h后采用流式细胞检测DC细胞表面免疫调节分子表达及T细胞亚群分子标志物表达,同时采用RT-PCR检测DC细胞中IDO表达量。结果过表达IDO的BMSCs分泌的外泌体与DC细胞共培养使DC细胞CD40、CD86、CD80、MHCII、CD45RA+CD45RB、OX62等免疫促进分子表达率降低,而CD274表达率升高,同时DC细胞中IDO表达量增多;而过表达IDO的BMSCs分泌的外泌体与T细胞共培养组使T细胞亚群中的Treg细胞数量增加,CD4阳性T细胞变化无规律性,但CD8阳性T细胞减少。结论过表达IDO-BMSCs分泌的外泌体可通过抑制DC活性和上调Treg细胞数量,产生免疫抑制作用。

多发性骨髓瘤细胞分泌外泌体对破骨细胞分化的调控及其机制

目的探究多发性骨髓瘤外泌体调控破骨细胞分化相关基因表达的功能及机制。方法为了探究多发性骨髓瘤细胞对破骨细胞分化的影响,实验分为control组(THP-1细胞)、OPM2组(THP-1+OPM2细胞)、U266组(THP-1+U266细胞)、OPM2+GW4869组(THP-1+OPM2细胞+GW4869)和U266+GW4869组(THP-1+U266细胞+GW4869)。提取OPM2和U266细胞分泌的外泌体(OPM2 exo和U266 exo),透射电镜观察外泌体结构,Western blot鉴定外泌体标志蛋白TSG101、Hsp70、CD9。为了探究外泌体对破骨细胞分化的影响,实验分为OPM2 exo组(THP-1细胞+OPM2 exo)、U266 exo组(THP-1细胞+U266 exo)和PBS组(THP-1细胞+PBS)。qRT-PCR检测所有组细胞中活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1,NFATc1)、细胞原癌基因c-Fos、组织蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)mRNA相对表达量,Western blot检测所有组THP-1细胞NFATc1、c-Fos、CTSK、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)、动力蛋白激活蛋白4(dynactin 4,P62)蛋白表达量。结果OPM2 exo和U266 exo粒径在100 nm左右,“杯托”样结构,并且表达标志蛋白TSG101、Hsp70、CD9。相比于control组,OPM2组和U266组THP-1细胞NFATc1、c-Fos、CTSK mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.001),LC3Ⅱ蛋白表达显著上调(P<0.001),P62蛋白表达显著下调(P<0.001)。OPM2+GW4869组细胞NFATc1、c-Fos、CTSK mRNA和蛋白表达显著低于OPM2组(P<0.001),U266+GW4869组细胞NFATc1、c-Fos、CTSK mRNA和蛋白表达显著低于U266组(P<0.001)。相比于PBS组,OPM2 exo组和U266 exo组NFATc1、c-Fos、CTSK mRNA和蛋白表达显著上调(均P<0.001),LC3Ⅱ蛋白表达显著上调(P<0.001),P62蛋白表达显著下调(P<0.001)。结论多发性骨髓瘤细胞外泌体可能通过促进细胞自噬诱导破骨细胞分化。