青钱柳法呢基焦磷酸合成酶基因的克隆及功能研究

青钱柳是集药用、材用和观赏等多种价值于一身的珍贵树种。法呢基焦磷酸合成酶(FPS)催化=牛儿基焦磷酸(GPP)与异戊烯基焦磷酸(IPP)缩合成法呢基焦磷酸(FPP),FPP是植物次生代谢产物倍半萜,三萜,甾醇等的前体。本研究通过RACE方法首次从青钱柳中扩增了法呢基焦磷酸合成酶的全长cDNA序列,序列命名为CpF-PS(Genbank登录号为GU121224),序列长度为1 420 bp,包含1 029 bp的开放阅读框,编码342个氨基酸残基,预测蛋白分子量为39.60 kDa。通过BlASTP分析,推断的青钱柳FPS蛋白序列与木本棉(Gossypium arboreum)(CAA72793.1)、橡胶树(Hevea brasiliensis)(BAF98301)等的FPS蛋白相似度较高。蛋白质保守区、特征区以及进化树分析初步证实扩增到的全长cDNA序列为青钱柳的FPS基因。将该基因连入酵母表达载体并转入麦角甾醇缺陷型酵母菌株CC25(MATa/MATalpha,deltaERG20/+),发现该基因可弥补营养缺陷使得CC25菌株在高温中正常生长,证明所得到的青钱柳CpFPS基因编码的蛋白是有功能的蛋白。

植物法呢基焦磷酸合成酶的生物信息学分析

采用生物信息学的方法和工具对已在GenBank上注册的番茄(Lycopersicon esculentum)、橡胶(Hevea brasiliensis)、香蕉(Musa acuminata)、苹果(Malus×domestica)、向日葵(Helianthus annuus)、葡萄(Vitis vinifera)等的法呢基焦磷酸合成酶的核苷酸及氨基酸序列进行分析,并对其组成成分、转运肽、跨膜拓朴结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级及三级结构、分子系统进化关系等进行预测和推断。结果表明:该酶基因的全长包括5’、3’非翻译区和一个开放阅读框;其编码的蛋白是一个无跨膜结构域、不具转运肽的亲水性蛋白,包括5个保守的结构motif,其中两个是富含天冬氨酸(Asp)的motif,α-螺旋和不规则盘绕是蛋白质二级结构最大量的结构元件,β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中,蛋白质的功能域在空间布局上是由α-螺旋围绕形成的中间具一个“大空穴”的立体结构,“大空穴”的表面藏有五个功能保守motif,其中两个Asp-motif位于“空穴”的内壁。

罗汉果法呢基焦磷酸合成酶基因的克隆及其序列分析

目的对罗汉果甜苷V生物合成途径的关键酶法呢基焦磷酸合成酶(Farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)基因的全长cDNA序列进行克隆,为研究罗汉果甜苷V生物合成与基因调控奠定基础。方法根据植物FPPS基因保守功能域设计简并引物,通过PCR和RACE方法克隆罗汉果FPPS基因的全长cDNA。结果获得罗汉果FPPS(SgFPPS)基因的全长cDNA序列共1 354个核苷酸,包含一个1 026核苷酸的开放阅读框架(open reading frame,ORF),cDNA编码的蛋白包含342个氨基酸,推断蛋白质相对分子质量为3.92×104。NCBI Blastx结果显示,SgFPPS基因编码的蛋白与苹果树来源FPPS具有最高同源性,氨基酸一致度达85.1%。SgFPPS具有异戊烯基转移酶的5个典型保守功能域。进化树分析结果显示,SgFPPS基因与苹果树的FPPS具有较近的亲缘关系。结论首次克隆SgFPPS基因的全长cDNA序列,为分析SgFPPS基因表达特性及其在罗汉果甜苷V生物合成中的功能奠定基础。

广藿香法呢基焦磷酸合成酶基因(FPS)的克隆及生物信息学分析

为进一步阐明广藿香(Pogostemon cablin (Blanco) Benth.)中百秋李醇(Patchouli alcohol)生物合成的分子调控机制,本研究采用RT-PCR技术从广藿香叶片中克隆得到法呢基焦磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase) FPS基因,并通过qRT-PCR技术分析FPS基因在广藿香幼苗期(扦插后60 d)与成熟期(扦插后240 d)叶片中的相对表达量。对克隆得到的广藿香FPS基因进行生物信息学分析,序列片段长为1 177 bp,其中包含1个长度为1 050 bp的开放阅读框,编码由349个氨基酸残基构成的蛋白质,与其它已知FPS氨基酸序列的唇形科植物一致性高达93.10%,与已知的米团花(Leucosceptrum canum Smith) FPS蛋白亲缘关系最近。预测FPS蛋白质分子质量约为40.09 kD,理论等电点(pI)为5.34,推测其为亲水性蛋白,无跨膜区且不含信号肽,属于类异戊二烯生物合成家族。qRT-PCR结果表明FPS基因在成熟期叶片中表达量高于幼苗期,与转录组数据分析结果一致。本研究结果为进一步研究FPS基因在广藿香中的应用,探究广藿香中百秋李醇生物合成途径中关键酶的表达模式及通过调控百秋李醇生物合成提高广藿香挥发油中有效成分含量提供了理论依据。

洋常春藤法呢基焦磷酸合酶基因的克隆与序列分析

以洋常春藤叶片为材料,采用同源RT–PCR方法,克隆获得了洋常春藤法呢基焦磷酸合成酶基因,其c DNA序列大小为1 050 bp,开放阅读框为1 026 bp,推测编码342个氨基酸残基,该序列的核苷酸、氨基酸与五加科植物有同源性;用在线数据软件进行分析,推测该蛋白可能存在于细胞质之中,定位在细胞膜外,FPS蛋白的相对分子质量为39 735.7;该蛋白含有2个天冬氨酸保守结构域,其二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主;双子叶植物系统进化树分析结果表明,洋常春藤的FPS与刺五加、人参、三七、西洋参、辽东楤木的FPS亲缘关系最近,这一结果符合传统的分类法规则。

红树林植物杯萼海桑法呢基焦磷酸合酶的基因克隆及序列分析

目的对杯萼海桑Sonneratia alba萜类化合物生物合成途径的关键酶法呢基焦磷酸合成酶(Farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)基因的编码cDNA序列进行克隆,为研究杯萼海桑萜类化合物生物合成与基因调控奠定基础。方法结合杯萼海桑根的转录组注释,根据编码区序列设计引物,通过PCR方法克隆杯萼海桑FPS(SaFPS)基因的编码区cDNA。结果PCR扩增了一个长1 029 bp的基因片段,该片段编码由342个氨基酸组成的SaFPS。同源性比对结果显示基因编码蛋白与甘草的FPS具有氨基酸一致性达86%。其具有异戊烯基转移酶的2个典型保守功能域。进化树分析结果显示,与甘草Glycyrrhiza uralensis、苜蓿Medicago truncatula、羽扇豆Lupinus albu具有较近的亲缘关系。实时荧光定量PCR结果显示SaFPS基因在花中表达量较高,果实、茎、叶中表达量相对较低。结论首次从红树林植物杯萼海桑中克隆FPS基因获得其编码区序列,SaFPS基因具有组织表达特异性。本研究为分析基因表达特性及其在生物合成中的功能奠定基础。

长春花法呢基焦磷酸合酶基因的克隆与组织表达分析

萜类吲哚生物碱是重要的植物次级代谢产物,是多种天然药物的药效基础,具有显著的消炎、抗病毒、抑制肿瘤等作用。而长春花(Catharanthus roseus)作为重要的药用植物可以通过次级代谢合成150多种萜类吲哚生物碱,但是长春花萜类化合物的代谢途径尚未完全解析,究其原因则是受到代谢通路中关键酶的限制。法呢基焦磷酸合成酶(FPPS)是植物萜类物质合成途径中的关键酶之一,但仅发现在拟南芥等植物的萜类化合物合成过程中发挥重要的作用。因此,为了深入探究FPPS对长春花次级代谢途径是否也发挥重要作用,本研究通过生物信息学、分子生物学等研究手段,基于拟南芥法呢基焦磷酸合成酶序列,对长春花转录组数据库进行序列比对分析,首次发现并成功克隆两个FPPS同源基因,并将其命名为CrFPPS1与CrFPPS2。进一步通过系统进化树分析表明,CrFPPS1和CrFPPS2与拟南芥、缬草等植物FPPS的氨基酸序列相似性均在80%以上。RT-qPCR结果显示CrFPPS在长春花不同组织表达特征不同,因此推测CrFPPS1与CrFPPS2的功能并不完全相同。初步表明CrFPPS是长春花次级代谢通路上具有生物学功能的蛋白质,这为研究长春花FPPS的功能及长春花次级代谢产物的生物合成奠定了理论基础。

双膦酸盐类化合物的研究进展

双膦酸盐类化合物是防治骨代谢疾病的重要药物 ,本文对双膦酸盐类药物的临床应用、构效关系、作用机制进行了综述 。