悬浮法培养C6胶质瘤细胞系和该细胞系中脑肿瘤干细胞的分离

目的研究应用无血清培养基悬浮法培养C6胶质瘤细胞系的方法;并分离该细胞系中的脑肿瘤干细胞,观察其生长方式和分化特征。方法应用培养大鼠神经干细胞的培养基和培养方法,在无血清培养基中采用悬浮法培养大鼠C6胶质瘤细胞系;再将分离获得的悬浮生长的脑肿瘤干细胞接种于含血清培养基,观察其分化;应用有限稀释和单克隆形成实验确定该细胞系中肿瘤干细胞的比例。结果C6胶质瘤细胞系中有约1.18%的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活、增殖,形成自由漂浮的细胞球;这种细胞球具有人脑肿瘤干细胞球的特征,并可连续传代,若重新接种于含血清培养基中可重新贴壁分化,贴壁分化后细胞形态与直接在含血清培养基中培养的C6胶质瘤细胞系无明显差别。结论C6大鼠胶质瘤细胞系中含有比例较低的、具有增殖和分化能力脑肿瘤干细胞(约1.18%),该细胞系可在含生长因子的无血清培养基中悬浮生长,并维持细胞系。

三维悬滴法培养间充质干细胞在组织损伤修复中的应用及优势

背景:近年来,间充质干细胞因其易于分离培养、具备高度自我增殖和多向分化潜能以及强大的免疫调控作用等优点,被广泛用于各种组织的损伤修复。传统的二维培养常常导致细胞的多能性及分泌能力受损。三维成球培养的间充质干细胞,不仅能很好继承间充质干细胞本身的优点,还能通过增强的旁分泌能力和增殖分化能力,扩大其在多种组织损伤中的修复作用。目的:从三维间充质干细胞的基本特征、修复机制、培养方法以及对于各类疾病损伤修复的组织工程应用等多个方面进行综述,阐述其未来应用的可能性,为将来三维间充质干细胞的临床应用提供理论支持。方法:计算机检索近10年收录于PubMed数据库、中国期刊全文数据库(CNKI)以及万方数据库中的相关文章,检索关键词为“间充质干细胞、三维培养、悬滴法培养、损伤修复”“mesenchymal stem cells、three-dimension culture、hanging-drop、tissue repair”,文献类型不限,纳入51篇文献进行综述分析。结果与结论:多项研究表明,三维间充质干细胞确实在多个方面如增殖分化、旁分泌及免疫调控作用等要远强于二维间充质干细胞,从而更好地修复组织损伤。随着干细胞移植治疗的广泛开展和三维成球培养体系的深入研究,三维间充质干细胞用于多种组织损伤的修复具备巨大潜力。

胰酶消化法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞

建立胰酶消化法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞 ,并和其他大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养方法相比较。在无菌条件下分离雄性Wistar大鼠胸主动脉血管中膜 ,剪碎中膜 ,在 37℃用 10mL 0 .2 5 %胰酶消化大约 3.5h。中止消化后 ,在 10 0g条件下离心 5min ,收集细胞种入 2 5cm2 细胞培养瓶。结果发现 ,胸主动脉平滑肌细胞至少可以传 2 0代以上 ,并且细胞形态、生长特点、平滑肌a 肌动蛋白表达不发生明显的改变。结果提示 ,与目前的平滑肌细胞培养方法相比 ,胰酶消化法培养平滑肌细胞的方法重复性好 ,原代培养的平滑肌细胞具有数量多、生长迅速的特点。

全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的方法,研究MSC的生物学特性。方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSC,体外培养和连续传代,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化;利用四唑盐比色(MTT)法测定MSC的生长曲线;流式细胞仪(FCM)鉴定MSC膜抗原。结果原代分离的MSC在接种后48 h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化。细胞传代后2天内处于潜伏期,3天后进入生长期,7天后进入平台期。FCM检测CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。

双层夹心法培养大鼠Kupffer细胞

目的 建立可长时间维持细胞功能 ,减少细胞破坏的Kupffer细胞培养方法。方法 细胞破坏以乳酸脱氢酶(LDH)含量反映 ,细胞功能以一氧化氮 (NO)和胞内酸性磷酸酶 (ACP)水平反映。以双层夹心法 (doublecollagenculture ,DCC)对比普通培养法 (commonculture,CC)和单层胶原培养法 (singlecollagenculture ,SCC) ,在有或无血清状态下 ,Kupffer细胞功能维持和破坏情况。 结果 双层夹心法在培养 15d内 ,能降低培养上清LDH含量 ,维持NO和胞内ACP水平 ,并可在无血清状态下减少细胞破坏 ,维持细胞功能 ,与另两种方法相比作用显著。结论 双层夹心法对体外研究Kupffer细胞具有实际应用价值。

大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织贴块法培养及鉴定

目的 :建立大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织贴块培养法。方法 :取大鼠胸主动脉 ,切成1 mm× 1 mm× 1 mm的小块 ,均匀地种植于培养瓶壁上 ,约 5 0 min后加入含有 2 0 %小牛血清的PRMI- 1 640培养基进行培养。结果 :培养第 5天时 ,可见少量梭形或长梭形细胞自组织块周围游出 ,至培养 3周细胞融合成片 ,呈“峰、谷”状生长。肌动蛋白免疫组化染色 ,>98%的细胞染色阳性 ,透射电镜观察 ,于基膜下和胞浆内可见密斑和密体。 VG染色也证实几乎所有的细胞均为平滑肌细胞。结论 :应用细胞贴块法培养大鼠平滑肌细胞 ,操作简单 ,结果稳定 ,纯度较高 。

二步法培养盐藻生产天然β-胡萝卜素的研究

将盐藻在最适生长条件下培养4～5天后，逐渐过渡到β－胡萝卜素最适累积条件下，结果表明；二步法培养所获得的β－胡萝卜素比最适条件下直接培养的高出46％，二步露天培养的β－胡萝卜素产量达到38．5mg／L，比高密度粗放直接培养所得到的产量高出1倍以上，说明二步法的实际应用是可行的。

两种方法培养人早孕绒毛滋养层细胞的比较

背景:人早孕绒毛滋养层细胞体外培养是研究各种妊娠疾病的基础,如何获得纯度高、数量多的滋养层细胞以及如何简化实验步骤,仍是目前研究的热点。目的:寻求一种培养高纯度人早孕绒毛滋养层细胞方法。方法:取5～10周正常绒毛组织,胰酶消化和差速贴壁联合应用法与组织块培养法分别进行人早孕绒毛滋养层细胞原代培养,免疫组织化学观察细胞角蛋白7和波形蛋白的表达,进行滋养层细胞纯度的鉴定。结果与结论:两种方法均能培养出人早孕绒毛滋养层细胞,呈三角形,多边形。抗-细胞角蛋白7阳性表达,抗-波形蛋白阴性表达。胰酶消化和差速贴壁联合应用法培养细胞纯度高于组织块培养法(P<0.05)。提示胰酶消化和差速贴壁联合应用法是一种培养人早孕绒毛滋养层细胞较好的方法。

共生法培养外生菌根菌菌丝体

首次报道外生菌根菌的共生培养法。初步研究了一个较好的外生菌根菌菌丝体培养方法,即将宿主的愈伤组织与外生菌根共同培养,可以明显地促进真菌菌丝的萌发和生长。愈伤组织匀浆液也可促进菌丝体早期生长。

全骨髓法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

目的建立一种体外纯化及培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的简便有效方法。方法全骨髓法分离培养SD大鼠MSCs,通过体外培养和连续传代达到纯化和扩增MSCs目的。倒置显微镜下观察细胞形态变化情况;利用四唑盐比色(MTT)法测定MSCs的生长曲线;流式细胞仪(FCM)鉴定MSCs膜抗原。结果 SD大鼠胫骨全骨髓细胞在分离后与含10%优质胎牛血清DMEM培养基混合,约5～10min后即可见大量有核细胞贴壁,细胞形态为圆形,24～48h后可见贴壁细胞转变为椭圆形、多角形及短梭形,7～12d时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。通过传代细胞进一步纯化及扩增。细胞传代后2d内处于潜伏期,3d后进入生长期,5d后进入平台期。FCM检测第4代MSCs膜表面抗原CD45、CD90、CD29阳性率分别为1.50%、99.18%、97.70%。结论 SD大鼠全骨髓贴壁法能有效得到分离纯化的MSCs,用此方法培养的SD大鼠MSCs生长稳定,增殖能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性,可以为组织工程提供理想的种子细胞。为本实验研究打下基础。

用胶原酶消化法培养德保矮马耳缘组织成纤维细胞初探

将德保矮马耳缘组织经胶原酶消化法培养成原代细胞,并成功建立起该组织成纤维细胞系。这种细胞贴壁生长,具有密度接触性抑制性质;该方法获得的原代细胞经传代后接种,细胞群体倍增时间(PDT)为35.9h;细胞染色体众数2n=64的细胞数占91.3%～92.8%;乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶分析,没有其它细胞系污染;细菌、真菌、病毒、支原体检测阴性。该系符合ATCC要求的细胞系鉴定项目,成为保护矮马这一国家重要畜禽品种的宝贵遗传资源,并为相关遗传学研究提供了有效的试验材料。同时得出胶原酶消化培养法比组织块培养法在获得原代细胞速度快;组织块培养法的细胞群体倍增时间(PDT)为48h。

凝集法培养法镜检检验念珠菌阴道炎患者阴道分泌物分析

目的探究不同微生物检验法在念珠菌阴道炎临床检验中的应用效果。方法选取就诊的念珠菌阴道炎患者156例进行临床研究,所有患者均行阴道分泌物检查,统计并对比凝集法、培养法、镜检法三种检验方法阳性检出率,客观评价不同检验方法的应用价值。结果镜检法阳性检出率为90. 38%,培养法阳性检出率为85. 90%,凝集法阳性检出率为83. 33%,镜检法阳性检出率明显高于培养法和凝集法(P <0. 05),培养法阳性检出率略高于凝集法(P <0. 05)。结论镜检阴道分泌物检验法能够提高念珠菌阴道炎阳性检出率,应用效果优于凝集法和培养法,可作为念珠菌阴道炎常规诊断方案加以推广。

用模式法培养学生的课堂教学能力

根据控制论、系统论和信息论的基本原理,把模式训练法移植到培养高师体育学生课堂学能力之中,建立课堂教学能力的最佳模式,探讨培养学生能力的新途径。

两种方法培养结核分枝杆菌的比较

结核病是严重威胁人类健康的传染病。结核病的确诊有赖于病原学检查,而传统的改良罗氏培养法(L-J法)由于所需时间较长,不能满足临床需要。我院于2003年3月份引进生物梅里埃公司的BacT／ALERT3D 120型全自动细菌培养系统,能快速地培养出结核分枝杆菌。现与传统的L-J法比较如下:

半固体培养法制备非洲猪瘟病毒pA104R蛋白的单克隆抗体

为了快速、高效制备非洲猪瘟病毒(ASFV)单克隆抗体,本研究通过大肠杆菌系统表达并纯化了ASFV重组蛋白pA104R。以ASFV重组蛋白pA104R为抗原,分别比较了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂和常规弗氏佐剂两种免疫策略,并重点比较半固体培养法和常规有限稀释法来制备ASFV pA104R单克隆抗体的效率。结果显示,本研究获得了相对分子质量为3.5×104的ASFV重组可溶性蛋白pA104R,通过其与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫小鼠,在第21 d即可达到融合要求,本试验方法(重组蛋白pA104R与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫)较重组蛋白pA104R与常规弗氏佐剂免疫节省14 d时间。通过半固体培养法筛选单克隆的试验周期比有限稀释法缩短28 d,并减少了亚克隆的工作量。半固体培养法获得5株阳性杂交瘤细胞,挑选效价较高的3株(9A4、9H6、11F5)进行鉴定,重链均为IgG,轻链均为KAPPA。纯化后的3株单克隆抗体针对pA104蛋白和全病毒蛋白质的效价分别达1∶160000~1∶320000和1∶200~1∶400。本研究优选了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂结合半固体培养法筛选pA104R的单克隆抗体,为单克隆抗体制备提供了快速高效的新策略。

组织培养法保存新鲜同种异体骨软骨移植物的研究进展

关节软骨(articular cartilage,AC)因无血管和神经的解剖学特性而具有免疫特权,非常适合同种异体移植手术[1]。同种异体骨软骨移植(osteochondral allograft,OCA)技术治疗由骨坏死、剥脱性骨软骨炎和创伤性损伤等引起的软骨缺损疗效显著[2-3]。传统上,OCA技术是在移植物获取后7d内植入的,具有较高的软骨细胞活性,新鲜的同种异体骨软骨移植物(osteochondral allografts,OCAs)5年生存率已经超过80%[2-4]。