泛素—核糖体蛋白S27a基因的克隆、测序及其原核GST融合表达和纯化

目的:克隆泛素—核糖体蛋白S27a基因并在大肠杆菌细胞内高效表达,并纯化该蛋白。方法:从HL-60细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得泛素/核糖体蛋白S27a的编码区cDNA,将HindⅢ/NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样双酶切的GST融合表达载体pGEXGST构建为融合表达质粒pGEXGST-S27a,转化感受态的大肠杆菌JM109实现质粒的扩增与纯化,经DNA测序确证后再转化感受态表达菌BL21,表达并纯化出融合蛋白。结果:(1)PCR扩增获得长约560bp的泛素—核糖体蛋白S27a基因片段。(2)SDS-PAGE证明,泛素—核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白的分子量为43kDa。(3)通过过柱法纯化出泛素—核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白。结论:成功克隆出泛素-核糖体蛋白S27a的基因,并在表达菌BL21中可见GST融合表达,并纯化出该融合蛋白,为进一步研究其功能获得了候选蛋白分子。

用酵母双杂交系统筛选泛素/核糖体蛋白S27a

背景与目的:蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,在细胞增殖和分化、信号的传导和加工等方面起重要作用。CK2在多种白血病细胞中的活性比相应的正常组织高2～8倍,且CK2的变化与肿瘤的生长情况相关。为研究其在白血病细胞中的作用机制,本研究拟利用酵母双杂交系统从自行构建的HL鄄60细胞cDNA文库中筛选出与蛋白激酶CK2α'亚基相互作用的蛋白。方法:通过PCR扩增已构建成功的重组质粒pTHCK2A',获得人CK2α'亚基编码区cDNA;将PstⅠ/NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样酶切的“诱饵”载体pGBKT7,构建酵母双杂交穿梭表达质粒(BD质粒),经DNA测序确证及转染感受态酵母菌AH109以排除自主激活。从体外培养的HL鄄60细胞中提取总RNA,以酵母穿梭表达质粒pGADT7鄄Rec为载体,采用CLONTECHSMART(switchingmechanismat5'endofRNAtranscript)技术,在酵母细胞中构建HL鄄60细胞的酵母双杂交cDNA文库,文库质粒为AD质粒。将上述构建成功的BD质粒、AD质粒共转染感受态酵母菌AH109,进行酵母双杂交实验。以筛选真阳性克隆(即与人蛋白激酶CK2α'相互作用的蛋白)。结果:经过酵母双杂交实验,筛选出6种与蛋白激酶CK2α'相互作用蛋白,核酸序列分析及同源性检索表明,其中1个与泛素/核糖体蛋白S27a有高度?

小麦条锈菌泛肽-核糖体蛋白S27a基因的鉴定与表达分析

从小麦条锈菌吸器cDNA文库中鉴定到一个泛肽-核糖体蛋白S27a(Ubiquitin-ribosomal protein S27a,UBRS27a)基因,命名为PsUBRS27a。该基因开放阅读框为480bp,编码包含159个氨基酸残基的蛋白质,其氨基酸序列含有典型的UBRS27a蛋白所具有的ubiquitin和Ribosomal_S27结构域;序列比对发现UBRS27a蛋白在不同物种中高度保守,但PsUBRS27a蛋白在进化上与柄锈菌属的UBRS27a蛋白亲缘关系最近;种内多态性分析发现PsUBRS27a基因在不同小麦条锈菌菌系中的序列非常保守,无核苷酸变化;实时荧光定量PCR结果表明,PsUBRS27a基因在条锈菌侵染小麦过程中呈上调表达趋势,高峰期为接种后168h。

核糖体蛋白S27a在骨肉瘤组织中的表达及临床意义

核糖体蛋白（ribosomal protein,RP）除组成核糖体、参与蛋白质生物合成之外,还具有参与复制、转录加工、修复、自体翻译、细胞凋亡调控以及正常细胞的恶性转化及发育调控等功能,与肿瘤的密切关系更是引人注目。有研究报道表明,一些RP参于肿瘤细胞增殖的调控,并与其恶性转化和进展有关。作为一种多功能的RP,RPS27a在多种活性增殖细胞和肿瘤组织中表达量显著增加,在细胞快速生长时过度表达。

人泛素-核糖体蛋白27a原核表达载体构建及表达

目的构建并表达携带谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的人泛素-核糖体蛋白S27a(UBRPS27a)原核表达载体。方法利用反转录聚合酶链反应从HL-60细胞中扩增RPS27A基因全长,克隆至pMD-19T载体中,酶切回收后插入原核表达载体pGEX4T-1,构建重组表达载体pGEX4T1-RPS27A,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达GST-UBRPS27a融合蛋白。结果经测序与酶切鉴定,重组质粒pGEX4T1-RPS27A构建正确;经重组质粒转化的BL21细菌诱导4h后可高效表达UBRPS27a融合蛋白。结论成功构建UBRPS27a原核表达载体,为进一步研究其结构、功能及其在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。

家蚕泛肽-核糖体蛋白S27a的表达及功能研究

泛肽(UB)-核糖体蛋白S27a(UBRPS27a)是泛肽和核糖体蛋白的融合蛋白,在真核细胞中表达时,被酶解成UB和核糖体蛋白S27a(RPS27a)。从家蚕蛹cDNA文库中获得了该基因并原核表达了该蛋白,命名为BmUBRPS27a。将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔得到抗血清,通过亚细胞免疫荧光定位发现该蛋白存在于细胞核和细胞质。用荧光定量PCR对该蛋白在家蚕中的表达作了初步分析,发现RPS27a在活性增殖细胞中表达量很高。将合成了BmUBRPS27a的dsRNA进行RNAi,用脂质体转染家蚕卵巢上皮细胞Bm5后,细胞的形态发生了变化:细胞由圆形、椭圆形变成了梭形,甚至出现类似神经细胞的突触结构。该基因对维持细胞正常形态具有重要的作用。

泛肽、核糖体蛋白及泛肽-核糖体蛋白S27a与肿瘤的关系

泛肽-核糖体蛋白S27a(Ubiquitin-ribosomal protein S27a,UBRS27a)是泛肽和核糖体蛋白的融合蛋白,N端为泛肽,C端由含C2-C2型锌指结构域的高度保守核糖体蛋白S27a构成。在真核细胞中表达时,被酶解成泛肽和核糖体蛋白。该多功能核糖体蛋白在各种活性增殖细胞和瘤组织中高度表达,在多种类型的肿瘤细胞中,该基因的过量表达是一个典型特征。本实验室对该蛋白在家蚕中的作了初步研究,也发现RPS27a在活性增殖细胞中表达量很高。大多数核糖体蛋白的功能还没有完全探明,它们不仅仅在组装成核糖体时起作用,往往还有核糖体外的功能。回顾了最近几年有关该融合蛋白以及与它相关的泛肽途径、核糖体蛋白与肿瘤之间的关系。通过对它们的研究,有可能预示肿瘤的发生和发展,并为肿瘤临床诊断提供依据,为恶性肿瘤的治疗提供靶点。

核糖体蛋白S9在多发性骨髓瘤中的表达及对其细胞生物学功能的影响

目的明确核糖体蛋白S9(RPS9)在多发性骨髓瘤中的表达情况,并明确其对骨髓瘤细胞生物学特性的影响及相应机制。方法 选取10例健康志愿者骨髓单个核细胞(CON组)与30例多发性骨髓瘤患者骨髓CD138+细胞(CD138+组),实时荧光定量PCR检测RPS9在mRNA水平的表达,并选取3例CON与11例CD138+细胞,Westernblot检测RPS9在蛋白水平的变化,同时选取GSE19784数据集,检测RPS9的表达与患者总体生存率、核因子-κB(NF-κB)、类泛素蛋白修饰分子(SUMO)、泛素通路之间的关系。随后构建RPS9-短发夹RNA(shRNA)敲低载体,使用流式细胞仪检测感染效率、实时荧光定量PCR与Westernblot检测敲低效率后。RPMI8226分为CON与RPS9-shRNA组,使用膜联蛋白V别藻青蛋白/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡的变化、CCK8法检测细胞增殖的变化、PI染色法检测细胞周期的变化。并构建类泛素蛋白修饰分子特异蛋白酶1(SENP1)过表达载体,Westernblot确定过表达效率后,检测RPS9抑制后SENP1表达的变化,并在RPS9-shRNA中转染SENP1过表达载体,Westernblot检测CON、RPS9-shRNA、RPS9-shRNA-SENP1细胞中NF-κB通路P65、抑制因子κBα(IκBα)磷酸化水平的变化,膜联蛋白V/PI双染法检测细胞凋亡的变化。结果 RPS9在10例健康志愿者骨髓单个核细胞(CON)以及30例多发性骨髓瘤患者骨髓CD138+细胞中相对表达量分别为1.00±0.12和5.45±0.71(t=4.291,P=0.0036),Westernblot中大多数骨髓瘤CD138+细胞中RPS9呈现高表达,RPS9的高表达同时与患者髓外浸润相关,并在GSE19784数据集中与患者总体生存率相关。RPMI8226在感染CON与RPS9-shRNA慢病毒48h后,流式细胞仪证实两组细胞感染效率均在90%以上,实时荧光定量PCR与Westernblot证实RPS9在mRNA与蛋白水平的表达均受到抑制。RPMI8226CON与RPS9-shRNA感染病毒48h后,CON与RPS9-shRNA组细胞膜联蛋白V阳性细胞比例分别为3.47±0.37和18.60±1.64,RPS9-shRNA组显著高于CON组(t=9.015,P=0.0008)。在增殖中,CON组与RPS9-shRNA组在72h时增殖指数差异有统计学意义(t=6.846,P=0.0024)。而在细胞周期中,CON与RPS9-shRNA组在感染病毒48h时,G2期细胞比例分别为(29.28±3.42)%和(10.43±1.43)%,CON组显著高于RPS9-shRNA组,差异有统计学意义(t=9.329,P=0.0007)。RPS9的表达在GSE19784数据集中与SENP1正相关,并与IκBα编码基因NFKBIA呈负相关,Westernblot进一步证实RPS9的敲低能够抑制SENP1的表达,并抑制NF-κB亚基P65、抑制因子IKBα的磷酸化,促进IKBα的表达,而SENP1的过表达不仅能够阻碍这一效应,也能够使RPS9诱导的凋亡减少。结论 RPS9在多发性骨髓瘤CD138+细胞中高表达,且与患者总体生存率、髓外浸润相关。RPS9的抑制能够促进骨髓瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞并抑制增殖。RPS9能够通过SENP1影响NF-κB通路的活化,并影响细胞的凋亡,提示SENP1可能为RPS9生物学效应的关键因素。

泛素、Skp2、p27在大肠癌组织中的表达及意义

采用组织芯片技术制作80例大肠癌癌组织芯片,S-P免疫组织化学方法检测芯片中泛素、S期激酶相关蛋白2(Skp2)和p27表达。结果泛素表达阳性率为45.0%,Skp2阳性率为47.5%,p27阳性率为38.8%;不同组织学类型大肠癌中泛素、Skp2、p27的表达未见明显差异(P>0.05);有淋巴结转移者Skp2阳性率显著高于无淋巴结转移者(P<0.01),p27阳性率显著低于无淋巴结转移者(P<0.01)。提示Skp2高表达和p27低表达与大肠癌的进展相关,Skp2和p27的表达可以作为评估大肠癌预后的参考指标;泛素和Skp2在p27的表达调控中起重要作用;应用组织芯片大规模高效检测临床组织样本是可行的,具有快速、方便、经济、准确的特点。

过表达血红素加氧酶-1、金属硫蛋白2A、泛素蛋白B、核糖体蛋白S27a对HepG2细胞增殖和侵袭力的影响

目的研究过表达目标蛋白(HMOX-1、MT2A、UBB、RPS27a)对人肝癌HepG2细胞增殖和侵袭力的影响。方法用目标蛋白的过表达质粒转染HepG2细胞株,用空载体转染HepG2作为对照组。应用MTT法测定细胞体外增殖能力;Transwell实验检测各组细胞的体外侵袭力。结果 MTT法结果提示过表达目标蛋白后,HepG2细胞株增殖能力较对照组明显增强,差异有统计学意义(P<0.05);Transwell实验结果表明,过表达HMOX1、RPS27a后,HepG2细胞侵袭能力较对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);过表达MT2A、UBB后,HepG2细胞侵袭能力与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论过表达目标蛋白可增强HepG2细胞的增殖和侵袭能力。

Skp2基因沉默对子宫内膜癌HEC-1A细胞p27蛋白表达及细胞增殖的影响

RNA干扰（RNAi）是一项新的使基因表达阻断的技术，一种广泛使体外基因失活或沉默的方法，足在转录水平抑制基因表达的一种研究基因功能的有力工具，不仅可用于研究基因功能，同时也为基因治疗提供丁一个新的重要技术。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase-associated protein2，Skp2）是泛素连接酶复合物的组成部分F-box蛋自家族成员之一，通过特异性结合磷酸化的底物，引起底物的泛素化降解，对细胞周期的调控起重要作用，在肿瘤研究中日益受到关注。

显齿蛇葡萄实时荧光定量PCR内参基因的筛选与验证

目的筛选适用于显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)的内参基因。方法设计简并引物,采用RT-PCR从显齿蛇葡萄中克隆6个候选内参基因片段,包括肌动蛋白基因(Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、18 S核糖体rRNA基因(18 S-rRNA)、α-微管蛋白基因(α-Tubulin)、β-微管蛋白基因(β-Tubulin)和多聚泛素酶基因(UBQ)。应用qRT-PCR技术检测这6个候选内参基因在显齿蛇葡萄不同组织器官中(茎尖、嫩叶、成熟叶、老叶、茎和根)的表达情况。借助Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种统计学软件综合评价6个内参基因的表达稳定性。通过苯丙氨酸解氨酶基因(Ag PAL)的表达分析对筛选出的内参基因进行稳定性验证。结果 18 S-rRNA、GAPDH和Actin的表达稳定性较好,适合作为显齿蛇葡萄不同组织基因表达研究的内参基因,以这3个基因为内参基因分析Ag PAL基因的相对表达量,结果发现它们在各组织器官中的表达变化趋势基本一致。结论确定显齿蛇葡萄qRT-PCR分析的合适内参基因,为后续相关基因表达研究奠定基础。