泛素偶联酶UBE2C/UbcH10荧光蛋白表达载体的构建及肝癌细胞中的表达

目的构建人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10荧光蛋白真核表达载体,并转染肝癌细胞,筛选建立稳定转染细胞株。方法从构建好的pMD19-T/UbcH10载体中PCR扩增UbcH10基因,PCR产物双酶切后克隆入pEGFP-N1真核表达载体中,构建真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10,进行双酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10和空载体pEGFP-N1利用脂质体Lip2000TM分别转染进入肝癌细胞SMMC7721中,建立肝癌细胞SMMC7721的G418细胞死亡曲线,选择G418的筛选浓度,经G418结合荧光显微镜观察筛选稳定转染细胞。将筛选获得的肝癌细胞进行有限稀释法单克隆化,收集单个细胞克隆扩大培养备用。结果经双酶切和测序鉴定,带有荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10构建成功,经脂质体介导真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10和空载体pEGFP-N1成功转入肝癌细胞SMMC7721中,经800μg/mL G418筛选并进行单克隆化获得稳定转染的细胞株SMMC7721-pEGFP-N1和SMMC7721-pEGFP-N1/UbcH10,阳性转化率达到94%以上。结论人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10稳定高表达肝癌细胞株的建立,为该蛋白在肝癌发生发展过程中的具体作用机制的研究奠定了基础。

立体定向手术治疗脑胶质瘤患者的疗效及其对血清泛素偶联酶2C、CXC趋化因子配体10水平的影响

目的分析立体定向手术治疗脑胶质瘤患者的疗效及其对血清泛素偶联酶2C(UBE2C)、CXC趋化因子配体10(CXCL10)水平的影响。方法收集2018年1月至2023年2月新乡医学院第三附属医院收治的45例脑胶质瘤患者的临床资料,依照手术方式不同分为2组,对照组22例接受传统开颅手术治疗,观察组23例接受立体定向手术治疗,比较2组疗效、术后1 a生存率、术前及术后6个月神经功能[神经功能缺损程度量表(NIHSS)]、免疫细胞[辅助性T细胞(Th)1、Th2、Th17]、生活能力[Barthel指数(BI)]以及血清UBE2C、CXCL10、炎症细胞因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-17(IL-17)、IL-2、IL-6]水平。结果观察组总有效率(100.00%)高于对照组(72.73%;χ^(2)=5.070,P=0.024);观察组术后1 a生存率(86.96%)高于对照组(54.55%;χ^(2)=5.750,P=0.017)。术后6个月,观察组NIHSS评分低于对照组,而BI评分高于对照组(t=6.728,P<0.001;t=5.339,P<0.001);观察组Th1高于对照组,而Th2、Th17均低于对照组(t=3.793,P<0.001;t=4.691,P<0.001;t=5.293,P<0.001);观察组血清UBE2C、CXCL10、TNF-α、IL-17、IL-2、IL-6水平均低于对照组(t=8.778,P<0.001;t=3.543,P=0.001;t=9.831,P<0.001;t=11.148,P<0.001;t=11.516,P<0.001;t=10.954,P<0.001)。结论立体定向手术治疗脑胶质瘤的效果显著,能有效改善患者神经功能、免疫功能、生活能力,抑制炎症细胞因子、UBE2C、CXCL10表达,延长患者生存。

过表达泛素偶联酶(UBE2C)对小鼠胚胎发育的影响

UBE2C(Ubiquitin-conjugating enzyme 2C)属于E2泛素偶联酶家族成员,较为明确的作用是调控有丝分裂检验点以及控制细胞周期进程,但其在小鼠胚胎中的作用尚不明确。本文首先探讨了小鼠多种组织以及胚胎不同发育时期UBE2C表达图谱,其次在小鼠受精卵中通过显微注射过表达UBE2C分析其对小鼠早期胚胎发育的影响。结果表明:过表达UBE2C后导致胚胎2-细胞发育阻滞,证明UBE2C在胚胎发育过程中具有重要功能,其作用可能是通过降解卵母细胞储存的母源蛋白,从而确保小鼠早期胚胎正常发育进程。

UBE2C调控前列腺癌干细胞样细胞自我更新能力的作用研究

目的探讨泛素偶联酶2C(UBE2C)在前列腺癌干细胞样细胞维持自我更新能力中的调节作用。方法采用磁激活细胞分选测定前列腺癌DU145和C4-2B细胞株中CD44+细胞比例;在DU145-CD44+及C4-2B-CD44+细胞株中转染si-UBE2C^1#、si-UBE2C^2#和si-UBE2C^3#序列,并设转染阴性序列的对照组;采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测3条序列的敲减效率;Western blotting检测转染后UBE2C蛋白的表达水平;QPCR检测细胞干细胞特性相关基因(KLF4、SOX2、Oct4、Myc、NANOG、ABCG2、CTNNB1、UBE2C、ACTB)的表达水平,倍比稀释成球实验检测肿瘤干细胞的成球能力和成球频率,CCK8细胞增殖实验检测肿瘤干细胞对多西他赛的敏感性。结果磁激活细胞分选测定显示,前列腺癌C4-2B和DU145细胞株分选后CD44+细胞比例分别为90.3%和98.3%。QPCR检测显示,在3条si-UBE2C序列转染后,UBE2C的表达水平与对照组比较均显著下降(P<0.01),其中si-UBE2C^1#和si-UBE2C^2#的敲减效率最高,用于后续干细胞特性相关实验。Western blotting检测显示,转染后DU145-CD44+和C4-2B-CD44+细胞株中UBE2C蛋白的表达水平显著降低(P<0.01)。QPCR检测显示,敲减UBE2C的表达能够显著抑制前列腺癌CD44+干细胞样细胞中干性相关基因Oct4、Myc、NANOG、ABCG2、CTNNB1、UBE2C和ACTB的表达。倍比稀释成球实验显示,在C4-2B-CD44+和DU145-CD44+细胞株中敲减UBE2C表达后,第一代和第二代前列腺癌干细胞样细胞的成球数量显著下降,同时前列腺癌干细胞样细胞的成球频率亦显著下降(P<0.05)。CCK8实验显示,敲减UBE2C表达后,C4-2B-CD44+细胞株中对照组、si-UBE2C^1#组和si-UBE2C^2#组多西他赛的IC50分别为42.3、7.5和3.6 nmol/L,DU145-CD44+细胞株中对照组、si-UBE2C^1#组和si-UBE2C^2#组多西他赛的IC50分别为56.2、11.2和5.0 nmol/L。结论UBE2C在前列腺癌CD44+干细胞样细胞维持干细胞特性中发挥重要作用,有望成为抑制前列腺癌干细胞样细胞的治疗靶点。