泛素特异性蛋白酶42调节人脂肪干细胞成骨向分化

目的:探索泛素特异性蛋白酶42(ubiquitin-specific protease 42,USP42)在人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,hASCs)体内外成骨向分化中的作用。方法:用慢病毒转染hASCs,构建敲低和过表达USP42的稳定转染细胞系,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及活性定量、茜素红S矿化结节染色及定量,检测实验组(敲低组和过表达组)及对照组在成骨诱导下hASCs成骨向分化能力的差异,通过定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测实验组及对照组成骨相关基因的表达水平,通过蛋白免疫印迹实验检测实验组及对照组成骨相关蛋白的表达水平,通过裸鼠异位成骨实验评价USP42在hASCs体内成骨向分化中的作用。结果:敲低组USP42的mRNA和蛋白表达显著低于对照组,过表达组显著高于对照组。成骨诱导7 d后,敲低组的ALP活性显著高于对照组,过表达组显著低于对照组;成骨诱导14 d后,敲低组茜素红S染色显著深于对照组,过表达组显著浅于对照组。qRT-PCR结果显示,成骨诱导14 d时,敲低组ALP、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)和Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,COLⅠ)的mRNA表达水平显著高于对照组,过表达组显著低于对照组。蛋白免疫印迹实验结果显示,成骨诱导14 d时敲低组runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、OSX和COLⅠ蛋白表达水平显著高于对照组,过表达组显著低于对照组。裸鼠皮下移植物苏木精-伊红染色结果显示,敲低组类骨组织百分比较对照组显著增高。结论:敲低USP42显著促进hASCs的体内外成骨向分化,过表达USP42显著抑制hASCs的体内成骨向分化,USP42可作为骨组织工程学潜在治疗靶点。

泛素特异性蛋白酶在胃癌中的作用研究进展

泛素特异性蛋白酶(USPs)是去泛素化酶家族诸多亚族之一,具有多种功能结构域和生物学功能,可通过泛素与蛋白底物解离来调控泛素化,从而调控细胞的凋亡、增殖、转移以及基因转录、间充质转化和免疫反应等。泛素是一种标记将要分解的蛋白质并存在于大多数真核细胞的小蛋白,其通过泛素化复合链式反应,使蛋白质水解。泛素化复合式链式反应存在不同位点,USPs可以作用于其位点,并影响生物体内的泛素化,对蛋白质的降解起到不同作用。USPs在多种肿瘤中表达,并通过一系列机制参与肿瘤发生发展,可作为癌症治疗靶点。本文就USPs在胃癌中的作用研究进展进行综述,以期为以USPs为靶点的胃癌治疗新药的研发提供资料。

部分泛素特异性蛋白酶生物学功能的研究进展

泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases,USPs)家族是去泛素化酶家族中成员最多的一种,主要存在于骨骼肌、心脏、肝脏、脑、胰腺等组织中,且在不同物种间有表达差异性。目前的研究表明,虽然USPs特异性选择水解的泛素链的机制还不清楚,但USPs在机体生命过程中有极大作用,USPs在调控肿瘤发生及转移、免疫调节、炎症反应、能量代谢、病毒感染等方面具有重要临床意义。本文综述了近年来部分USPs生物学功能的研究进展,期望能够对相关疾病的诊断及治疗提供新的思路。

抑制泛素特异性蛋白酶7改善血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大

目的探究泛素特异性蛋白酶7(USP7)抑制剂FT671在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的H9c2细胞肥大中的作用和潜在机制。方法将H9c2细胞随机分为四组:对照组、FT671组、AngⅡ组、FT671+AngⅡ组。利用α-actinin细胞免疫荧光染色检测心肌细胞表面积;Western blot检测心房钠尿肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)以及NADPH氧化酶4(Nox4)的蛋白表达水平;RT-PCR检测ANP、BNP、β-肌球蛋白重链(β-MHC)、IL-6、MCP-1、TNF-α的mRNA表达;TUNEL染色检测细胞凋亡情况;细胞计数试剂8(CCK8)实验检测各组细胞活力;活性氧(ROS)染色检测细胞内氧化损伤水平。结果与对照组相比,AngⅡ组USP7蛋白表达明显增加,而使用FT671后,USP7表达明显被抑制。与AngⅡ组相比,FT671+AngⅡ组心肌细胞面积减小;ANP、BNP、Bax的蛋白表达减少,ANP、BNP、β-MHC、Bax、IL-6、MCP-1以及TNF-α的mRNA表达减少;Bcl-2的蛋白和mRNA表达均增加。与AngⅡ组相比,FT671+AngⅡ组TUNEL阳性细胞明显减少,心肌细胞活力增强,ROS生成减少,Nox4、NLRP3蛋白表达减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论FT671通过抑制Nox4/ROS/NLRP3炎症通路减轻AngⅡ诱导的心肌细胞中的氧化应激和炎症反应,从而减轻心肌细胞肥大。

泛素特异性蛋白酶4对透明细胞肾细胞癌细胞增殖能力的影响

目的探讨人类泛素特异性蛋白酶4(USP4)对透明细胞肾细胞癌(KIRC)细胞增殖能力的影响。方法从TCGA数据库及GEO数据库中下载KIRC患者的基因表达及临床信息资料,进行转化及整理;同时利用Ualcan、HPA数据库等在线工具对数据库中的KIRC患者进行进一步分析,研究USP4表达与KIRC患者临床病理特征(包括TNM分期和病理分级)以及生存预后的关系。在KIRC细胞株Caki-1、OSRC-2中转染USP4干扰和过表达质粒,通过平板克隆、细胞计数试剂盒8实验检测USP4对KIRC细胞增殖能力的影响。结果生物信息学分析显示,USP4在KIRC组织中的mRNA及蛋白表达水平均明显低于癌旁正常肾脏组织(均P<0.05)。KIRC组织中USP4 mRNA表达水平与患者肿瘤T分期、病理分期、组织学分级、总生存率、疾病特异性生存率、无进展生存率均有关(均P<0.05);与性别、年龄、N分期、M分期均无关(均P>0.05)。细胞实验结果显示,USP4蛋白在Caki-1、OSRC-2细胞中显著过表达,而过表达USP4会明显降低Caki-1、OSRC-2细胞增殖能力和克隆形成能力(均P<0.05);敲低USP4会明显提高Caki-1细胞克隆形成能力(均P<0.05)。结论USP4在KIRC组织中低表达,而过表达USP4可抑制KIRC细胞增殖能力。

泛素特异性蛋白酶2、微RNA-432-5p在食管癌组织中表达及临床意义

目的 探讨食管癌组织泛素特异性蛋白酶2(USP2)、微RNA-432-5p(miR-432-5p)的表达及临床意义。方法 选取2014年6月至2016年6月在辽宁省肿瘤医院接受外科手术治疗的93例食管癌病人作为研究对象,取手术切除的食管癌组织及其癌旁组织,采用免疫组织化学法检测USP2的表达情况,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测组织中USP2 mRNA、miR-432-5p表达水平,以食管癌组织中miR-432-5p表达水平平均数分为miR-432-5p低表达组和miR-432-5p高表达组,分析食管癌组织USP2、miR-432-5p表达与食管癌病人临床病理特征的关系;使用生物信息学Targetscan网站搜索USP2、miR-432-5p是否存在结合位点,进一步分析食管癌组织USP2、miR-432-5p的相关性;采用Kaplan-Meier法分析USP2、miR-432-5p表达与食管癌病人预后的关系。结果 食管癌组织中USP2 mRNA表达水平(2.53±0.71比1.05±0.36)、USP2阳性率(55.91%比6.45%)明显高于癌旁组织(P<0.05),miR-432-5p表达水平明显低于癌旁组织(0.31±0.12比1.03±0.34,P<0.05);食管癌组织浸润深度(肌层)、TNM分期(Ⅲ期)、低分化、有淋巴结转移的食管癌组织中USP2阳性表达率均高于浸润深度(外膜)、TNM分期(Ⅰ、Ⅱ期)、中高分化、无淋巴结转移的食管癌组织(P<0.05),食管癌组织浸润深度(肌层)、TNM分期(Ⅲ期)、低分化、有淋巴结转移的食管癌组织中miR-432-5p表达水平均低于浸润深度(外膜)、TNM分期(Ⅰ、Ⅱ期)、中高分化、无淋巴结转移的食管癌组织(P<0.05);生物信息学Targetscan网站显示,USP2、miR-432-5p存在结合位点,进一步经Spearman法分析结果显示食管癌组织中USP2、miR-432-5p表达呈负相关(P<0.05),Kaplan-Meier结果显示USP2阳性表达者、miR-432-5p低表达者5年总体生存率低于USP2阴性组者、miR-432-5p高表达者(分别为16.032、7.210,P<0.05)。结论 USP2、miR-432-5p异常表达可能与食管癌的发生及预后有关,检测USP2、miR-432-5p水平对食管癌的早期防治及预后评估具有重要意义,为食管癌的临床治疗提供理论依据。

脓毒症患者血清泛素特异性蛋白酶13和组织因子水平与预后的相关性分析

目的探究血清泛素特异性蛋白酶13(USP13)和组织因子(TF)水平与脓毒症患者预后的相关性。方法选取2020年5月至2022年5月期间我院重症监护病房收治的脓毒症患者96例为研究对象,依据患者入住重症监护病房28 d后的生存情况,将脓毒症患者分为存活组(77例)和死亡组(19例),收集患者一般资料,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清USP13、TF水平,脓毒症患者血清USP13、TF水平与SOFA评分的相关性采用Pearson法分析,USP13、TF对脓毒症患者28 d预后的预测价值采用ROC曲线评估。结果死亡组APACHEⅡ评分、SOFA评分、PCT及TF水平均明显高于存活组,USP13水平明显低于存活组(P<0.05);SOFA评分越高,血清USP13水平越低,TF水平及28 d死亡率越高(P<0.05);血清USP13水平与SOFA评分呈显著负相关(r=-0.513,P<0.05),血清TF水平与SOFA评分呈显著正相关(r=0.487,P<0.05);ROC曲线显示,USP13对预后预测的AUC为0.751,截断值为52.00 pg/ml,其敏感度、特异度分别为94.74%、48.05%;TF对预后预测的AUC为0.770,截断值为70.12 pg/ml,其敏感度、特异度分别为73.68%、71.43%;二者联合对预后预测的AUC为0.849,明显高于二者单独预测(Z联合vs.USP13=2.015、P=0.044;Z联合vs.TF=2.262、P=0.024),其敏感度、特异度分别为73.16%、94.81%。结论USP13、TF在脓毒症不同预后患者血清中差异表达,二者均与脓毒症患者病情密切相关,USP13、TF联合预测脓毒症患者28 d死亡的效能较高。

泛素特异性蛋白酶25对KGN细胞胰岛素抵抗的影响

目的用适量胰岛素诱导卵巢颗粒细胞系KGN细胞构建胰岛素抵抗(IR)的模型,探究泛素特异性蛋白酶25(USP25)对KGN细胞IR状态的影响。方法培养KGN细胞,并加入不同浓度胰岛素处理,建立诱导IR细胞模型的适宜胰岛素浓度;敲低KGN细胞中USP25的表达,诱导IR细胞模型,得到4个处理组:未敲低USP25的非IR模型对照组(lv-con-NC)、敲低USP25的非IR模型组(lv-USP25-NC)、未敲低USP25的IR模型组(lv-con-IR)与敲低USP25的IR模型组(lv-USP25-IR)。用Western blot检测葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)和胰岛素相关通路p-AKT、AKT的表达水平;用葡萄糖氧化酶法检测细胞培养基上清中葡萄糖的含量,分析4组细胞葡萄糖摄取情况。结果与lv-con-NC组相比,lv-con-IR组葡萄糖摄取量显著下降(P<0.05),但lv-USP25-NC组葡萄糖摄取量无显著变化(P>0.05);与lv-con-IR组相比,lv-USP25-IR组的葡萄糖摄取量、GLUT4蛋白表达量和p-AKT蛋白表达量均显著升高(P<0.05)。结论敲低USP25可提高胰岛素信号通路中p-AKT以及GLUT4的表达,从而恢复KGN细胞葡萄糖摄取能力,改善KGN细胞的IR状态。

泛素特异性蛋白酶22通过调控雌激素受体α的转录活性抑制磷诱导的人动脉平滑肌细胞钙化

目的探讨泛素特异性蛋白酶22(USP22)与雌激素/雌激素受体(ER)之间的关系,并明确USP22在血管钙化过程中的作用及机制。方法用高磷培养基处理人动脉平滑肌细胞(HASMCs),建立血管钙化的细胞模型,并通过钙含量比色检测试剂盒及茜素红染色对该模型进行评价;Western blotting观察钙化过程中USP22蛋白水平的变化情况;双荧光素酶报告试验检测USP22对于ERα的转录调控作用;免疫共沉淀试验(co-IP)检测USP22与ERα之间的相互作用;对HASMCs进行过表达/沉默USP22之后再通过钙含量比色检测试剂盒检测钙化的改变。结果成功建立HASMCs钙化模型,钙含量比色检测试剂盒测定结果显示,细胞钙含量明显升高(P<0.05),茜素红染色也提示平滑肌细胞钙化阳性。随着钙化培养基处理时间的延长,Western blotting检测发现HASMCs的Runt相关转录因子(Runx2)与USP22蛋白表达量均有所升高。双荧光素酶报告试验结果显示,USP22可以抑制ERα的转录活性(P<0.05)。co-IP证实USP22与ERα之间可以结合。过表达USP22时,细胞钙化加重,Runx2表达也升高;沉默USP22时,细胞钙化减轻,Runx2表达也下降(P<0.05)。结论高磷条件可以诱导HASMCs钙化,HASMCs钙化时USP22表达水平升高,USP22可以通过与ERα直接结合的方式抑制其转录活性,USP22通过ERα促进钙化。

以铂类为基础的新辅助化疗疗效与胃癌临床病理特征及泛素特异性蛋白酶39的相关性研究

背景胃癌新辅助化疗是胃癌综合治疗的重要内容,取得了很好的结果,但是仍然有部分患者在治疗期间疾病进展,失去治疗机会。寻找能够预测新辅助化疗疗效的指标是今后研究的热点。目的探讨以铂类为基础的新辅助化疗疗效与胃癌临床病理特征及泛素特异性蛋白酶39(USP39)的相关性。方法选取2012—2013年在中国人民解放军总医院进行以铂类为基础的新辅助化疗的胃癌患者44例为研究对象,采用以铂类为基础的新辅助化疗SOX方案进行治疗,根据治疗效果分为有效组和无效组。收集患者的临床病理资料,采用免疫组织化学及Western blotting法检测USP39的表达。结果 44例患者采用以铂类为基础的新辅助化疗SOX方案,其中有效组23例,无效组21例。有效组与无效组患者性别、年龄、病程、血红蛋白、中性粒细胞分数(N)、淋巴细胞分数(L)、血清清蛋白水平及肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、术前化疗疗程比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。无效组患者N/L≥3及USP39阳性率高于有效组(P<0.05)。结论以铂类为基础的新辅助化疗治疗胃癌,有效组患者的N/L、USP39低于无效组,N/L、USP39有可能成为预测胃癌以铂类为基础的新辅助化疗疗效的有效分子。

泛素特异性蛋白酶对肿瘤细胞增殖侵袭转移的促进作用机制研究进展

细胞周期中的蛋白质降解受泛素连接酶和去泛素化酶(DUB)双向调控,泛素特异性蛋白酶(USP)是DUB中的主要成员,它可去除靶蛋白中的泛素,从而调节蛋白酶体的降解、定位和活性。USP在肿瘤细胞周期G1、S、G2和M期转化中发挥着重要作用,其可以通过各种信号通路来促进各时期之间的转换,从而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。USP可以通过促进细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖性激酶的上调或者抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的表达来促进肿瘤细胞增殖侵袭转移。

乳腺癌组织中泛素特异性蛋白酶18/干扰素刺激基因15表达水平及其临床意义

目的探究泛素特异性蛋白酶18(USP18)、干扰素刺激基因15(ISG15)在乳腺癌组织中的表达水平及临床意义。方法采用Ualcan数据库分析USP18、ISG15在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达情况及二者与乳腺癌预后的关系;选取渭南市中心医院2012年5月至2015年7月诊治的99例乳腺癌病人癌组织、癌旁正常组织进行研究。分别检测USP18、ISG15mRNA及其蛋白表达情况;分析乳腺癌组织USP18、ISG15表达水平与病人临床病理特征、预后的关系;Cox回归分析乳腺癌病人预后的影响因素。结果Ualcan数据库中乳腺癌组织USP18为18.40±4.17、ISG15 mRNA表达水平为168.56±43.95高于正常乳腺组织(10.00±3.14、30.76±8.23)(P<0.05);乳腺癌组织USP18、ISG15 mRNA表达水平高低与乳腺癌预后无明显相关性。乳腺癌组织USP18为1.67±0.53、ISG15 mRNA为1.86±0.61及蛋白阳性表达率均高于癌旁正常组织(1.03±0.34、0.99±0.33)(P<0.05);乳腺癌组织USP18、ISG15表达水平均与淋巴结转移、乳腺癌分子亚型、肿瘤分化程度、TNM分期相关(P<0.05);乳腺癌病人癌组织中USP18表达水平与ISG15呈正相关(P<0.05);USP18阳性组、ISG15阳性组乳腺癌病人术后60个月生存率均低于USP18阴性组、ISG15阴性组(P<0.05);淋巴结转移、TNM分期、USP18、ISG15均是影响乳腺癌病人不良预后的独立危险因素(P<0.05)。结论乳腺癌病人癌组织USP18、ISG15表达水平均较高,两者均与乳腺癌病人预后关系密切,检测乳腺癌组织USP18、ISG15水平有助于评估乳腺癌病人预后。

泛素特异性蛋白酶25在肿瘤中的研究进展

泛素特异性蛋白酶(USP)25作为USP家族成员,在各种疾病发生发展过程中发挥关键作用,包括代谢调节、免疫应答以及炎症反应等。近年人们对USP25结构和功能的研究越来越清晰,发现USP25能通过与信号分子相互作用调控多种细胞内外信号通路,USP25过度激活将导致细胞的异常增殖,并使其侵袭迁移能力增加,从而促进肿瘤的形成、发展。USP25在多种肿瘤细胞中均异常高表达,其在癌症中的作用机制也逐渐被揭示。USP25有望成为肿瘤治疗的一个潜在靶标,并具有重要的临床价值和广阔的应用前景。

急性缺血性脑卒中患者基质金属蛋白酶-9、诱导型一氧化氮合酶、神经元特异性烯醇化酶、神经导向因子-1与神经功能缺损及预后的关系

目的 探讨血清基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经导向因子-1(Netrin-1)水平与急性缺血性脑卒中(AIS)患者神经功能缺损及预后的关系,为临床诊治AIS提供参考依据。方法 选取2019年1月至2022年2月南京中医药大学附属南京医院(南京市第二医院)收治的81例AIS患者作为研究对象,根据美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分将其分为轻度组(25例)、中度组(30例)和重度组(26例);根据改良Rankin量表(mRS)评分将其分为预后良好组(57例)和预后不良组(24例);同时选取同期101例健康体检者作为对照组。检测并比较AIS患者和对照组研究对象血清MMP-9、iNOS、NSE、Netrin-1水平,并分析血清MMP-9、iNOS、NSE、Netrin-1水平与NIHSS、mRS评分的关系。结果 AIS组患者血清MMP-9、iNOS、NSE水平均高于对照组,血清Netrin-1水平低于对照组;与轻度组比,中度组、重度组患者血清MMP-9、i NOS、NSE水平呈升高趋势,血清Netrin-1水平呈降低趋势;预后不良组患者血清MMP-9、i NOS、NSE水平均高于预后良好组,血清Netrin-1水平低于预后良好组;经Pearson相关性分析,血清MMP-9、iNOS、NSE水平与NIHSS、mRS评分均成正相关,血清Netrin-1与NIHSS、mRS评分均呈负相关(均P<0.05)。结论 AIS患者的血清MMP-9、iNOS、NSE水平越高,血清Netrin-1水平越低,其神经功能缺损程度越严重,预后越差,对以上指标进行检测可对患者的病情进行判断,为临床后续治疗提供一定的参考依据,并可作为预后情况的评估指标。

泛素特异性蛋白酶39对肺癌细胞的生物学影响

背景 肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,也是死亡率最高的肿瘤。与大多数肿瘤相比,肺癌的治疗现状仍不容乐观,严重威胁着人类的健康。蛋白质泛素化是翻译后修饰之一,以不同的方式调节许多的细胞过程。泛素特异性蛋白酶39(ubiquitin specific protease 39,USP39)与多种肿瘤的发生发展密切相关,但其在肺癌中的作用机制仍有待探索。目的 构建USP39稳定过表达的人肺癌A549细胞系,观察USP39过表达对肺癌A549细胞的生物学影响。方法 采用慢病毒感染法构建USP39稳定过表达的A549 USP39细胞系,并用Western blot进行验证。利用克隆形成实验检测USP39过表达对A549细胞增殖的影响;利用划痕实验检测USP39过表达对A549细胞迁移能力的影响。结果 Western blot结果显示,A549USP39稳定过表达的A549细胞系构建成功。与对照组相比,克隆形成实验表明USP39稳定过表达可明显促进细胞增殖,划痕实验显示USP39过表达可显著增加A549细胞的迁移能力,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论 本实验成功构建了USP39稳定过表达的A549细胞系,并初步验证USP39过表达与肺癌细胞的增殖和迁移相关。

重组泛素样特异性蛋白酶1在大肠杆菌中的表达条件优化与分离纯化

目的确定重组泛素样特异性蛋白酶1(ubiquitin-like specific protease 1,Ulp1)在大肠杆菌中的最佳表达条件并进行分离纯化。方法采用DNA重组技术,构建重组质粒Ulp1-pET-28a,并转化到Escherichia coli BL21(DE3)细胞中,以IPTG诱导Ulp1原核表达,并从诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度方面确定其最佳表达条件,再以亲和层析法分离纯化Ulp1。结果SDS-PAGE分析表明,工程菌诱导温度为30℃、诱导时间为6 h、IPTG浓度为0.2 mmol/L时Ulp1表达量最高,表达量约为350 mg/L且成功进行了Ulp1的分离纯化。结论本研究成功进行了Ulp1原核表达条件的优化与分离纯化,为Ulp1在生物工程中的酶切应用奠定了实验基础。

泛素特异性蛋白酶15对结肠癌细胞上皮间质转化的影响

目的:研究泛素特异性蛋白酶15(ubiquitin specific peptidase 15,USP15)对结肠癌HCT116细胞上皮间质转化的影响。方法:TGF-β_1可诱导结肠癌细胞发生上皮间质转化。采用TGF-β_1处理HCT116细胞,同时采用人USP15特异性小干扰RNA(TGF-β_1+siUSP15)转染HCT116细胞,阴性对照序列(TGF-β_1+siScramble)作为对照。采用siUSP15转染结肠癌奥沙利铂耐药细胞株(HCT116/L-OHP),然后采用奥沙利铂处理48 h。阴性对照序列(siScramble)作为对照,实时荧光定量聚合酶链反应检测USP15、E钙黏蛋白和波形蛋白mRNA表达。Western印迹检测USP15、E-钙黏蛋白、波形蛋白的蛋白表达。细胞划痕实验检测HCT116的迁移能力。CCK8法检测细胞抑制率。结果:siUSP15能有效抑制USP15在HCT116中的表达。与TGF-β_1+siScramble组相比,TGF-β_1+siUSP15组细胞中E钙黏蛋白表达上调(P<0.05),而波形蛋白表达下降(P<0.05)。细胞划痕实验显示,与TGF-β_1+siScramble组相比,TGF-β_1+siUSP15细胞的迁移能力显著下降(P<0.05)。CCK8检测结果显示,USP15的表达下调能增加HCT116/L-OHP对奥沙利铂的敏感性(P<0.05)。结论:USP15在结肠癌细胞上皮间质转化过程中发挥重要作用。

泛素特异性蛋白酶2a的表达及催化机制

研究USP2a在肿瘤发生发展中的催化机制,设计引物对USP2a的关键氨基酸残基Asn218,Cys223,His464和Asn482进行点突变,分析突变后对USP2a催化活性以及底物特异性的影响。利用荧光检测方法测定USP2a-WT和USP2a-Ms的酶促动力常数,并采用LC-MS/MS与SDS-PAGE方法分析USP2a-WT和USP2a-Ms的异肽酶活性,获得了可溶性表达的USP2a-WT和USP2a-Ms重组蛋白。结果表明,氨基酸残基Cys223和His464突变后酶失去活性,其余突变体分解底物Ub-AMC的催化效率与野生型无显著差异,氨基酸残基Asn218和Asn482单独突变后对酶活性没有显著影响,但双突变体USP2a-N218A/D482A则显著降低酶活性。USP2a的氨基酸残基Cys223和His464直接参与酶的催化反应;氨基酸残基Asn218和Asn482可能通过形成Asn218-Asn482电子对在催化过程中起到稳定氨基酸残基His464的作用。

特异性泛素蛋白酶22在急性白血病细胞中的表达及其临床意义

目的探讨特异性泛素蛋白酶22(USP22)在急性白血病(AL)细胞中的表达及其临床意义。方法采用荧光定量PCR及Western blot检测USP22基因及蛋白在Jurkat、HL-60、K562、molt-4和NB4细胞系、急性白血病患者及阴性对照者骨髓单个核细胞中的表达量情况。结果 USP22在Jurkat、HL-60、K562、molt-4和NB4细胞系均有所表达。USP22 mRNA在急性白血病患者初诊组(33.90±9.58)、缓解组(1.81±0.53)中的表达量与阴性对照组(1.05±0.33)相比均上调,USP22蛋白在急性白血病患者初诊组(0.58±0.15)、缓解组(0.10±0.03)中的表达量与阴性对照组(0.05±0.02)相比均上调,差异均具有统计学意义(P<0.001);其中USP22 mRNA在初诊组高白细胞AL患者中的表达量(45.23±10.92)高于非高白细胞患者(26.73±6.12),USP22蛋白在初诊组高白细胞急性白血病患者中的表达量(0.69±0.16)高于非高白细胞患者(0.42±0.10),差异均具有统计学意义(P<0.001)。但USP22基因和蛋白在初诊组急性髓系白血病(AML)与急性淋巴细胞白血病(ALL)患者间的表达差异无统计学意义(P=0.531,0.377),并且本研究对急性白血病患者的临床转归进行了观察,与低表达USP22的急性白血病患者初次诱导缓解率(88.0%)相比,高表达的缓解率(66.67%)较低。结论 USP22在急性白血病中表达率较高,它的表达水平可能与白细胞数目有关,USP22可作为判断急性白血病患者预后的标志基因之一。

MicroRNA-30e-5p通过下调泛素特异性蛋白酶22抑制非小细胞肺癌的发生和发展

目的探讨microRNA-30e-5p(miR-30e-5p)是否可通过下调泛素特异性蛋白酶22(USP22)抑制非小细胞肺癌(NSCLC)的发生和发展。方法采用qPCR、蛋白质印迹法和免疫组织化学染色法检测miR-30e-5p、USP22在NSCLC组织和癌旁组织中的表达。NSCLC细胞株H460转染miR-30e-5p模拟物或miR-30e-5p抑制物后,利用qPCR和蛋白质印迹法检测细胞中miR-30e-5p、USP22的表达。构建USP22突变载体,采用荧光素酶报告基因检测miR-30e-5p在USP22基因中的结合位点。采用MTT法检测转染后H460细胞的增殖情况,并采用异种移植法检测裸鼠体内肿瘤生长情况。流式细胞术检测转染后H460细胞的周期阻滞和凋亡情况。结果 MiR-30e-5p、USP22在肿瘤组织中的表达均高于癌旁组织(P均<0.01)。在H460细胞中过表达miR-30e-5p后USP22 mRNA和蛋白的表达均下调(P均<0.01),而抑制miR-30e-5p表达后USP22mRNA和蛋白的表达均上调(P均<0.01)。NSCLC组织中miR-30e-5p与USP22的表达呈负相关(P<0.01)。miR-30e-5p可通过结合在3′UTR的特异序列负调控USP22的表达。过表达miR-30e-5p可抑制H460细胞的增殖、诱导细胞周期阻滞和凋亡,并抑制裸鼠体内肿瘤的生长(P<0.05,P<0.01);而抑制miR-30e-5p的表达可促进H460细胞的增殖、抑制细胞周期阻滞和凋亡(P<0.05,P<0.01)。结论 MiR-30e-5p可以下调USP22的表达,从而抑制NSCLC的发生和发展,提示其可作为NSCLC患者的潜在治疗靶点。