脊髓性肌萎缩症中运动神经元生存蛋白缺失抑制p53泛素化降解致其积累的研究

目的探究脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)中p53积累的分子机制。方法构建运动神经元生存基因(Survival motor neuron,Smn)敲低的稳转小鼠运动神经元细胞系NSC34,采用蛋白质印迹和荧光定量PCR检测蛋白和基因的变化;用蛋白合成抑制剂放线菌酮(Cycloheximide,CHX)抑制蛋白合成,蛋白质印迹检测p53蛋白降解情况,采用免疫共沉淀检测p53与MDM2结合情况;采用免疫荧光检测小鼠脊髓组织运动神经元数量,运用流式细胞仪分析细胞周期的分布。结果在Smn敲低的NSC34细胞中,p53蛋白水平显著增加,但是其基因水平未发生明显变化;当蛋白合成被抑制后,SMN缺失会抑制p53蛋白降解,p53积累后会调控下游MDM2表达显著增加,但是其与p53结合却显著减少;p⁃p53(Ser18)和acetyl⁃p53(K382)水平显著升高,K382乙酰化位点会影响p53泛素化结合,导致其泛素化被抑制;最终p53积累导致NSC34细胞和SMA小鼠脊髓组织中细胞周期阻滞和凋亡增加。结论SMN蛋白缺失通过抑制p53泛素化降解途径导致其积累,进而引起细胞周期阻滞和凋亡。

氯化两面针碱通过抑制p53泛素化降解诱导宫颈癌细胞凋亡的机制

目的探究氯化两面针碱(nitidine chloride,NC)对宫颈癌细胞凋亡的影响及其作用机制。方法以宫颈癌细胞系HeLa及SiHa为对象,通过CCK-8法和克隆形成实验检测NC的细胞毒性作用及对细胞生长的抑制作用。通过TUNEL法检测NC对宫颈癌细胞凋亡的影响,并采用Western blot法检测凋亡相关蛋白表达情况。运用免疫共沉淀实验、泛素化实验及Western blot实验分析NC对宫颈癌细胞中p53与E6AP蛋白相互作用、p53泛素化修饰水平、p53蛋白稳定性的影响。结果NC可明显抑制宫颈癌细胞增殖、诱导宫颈癌细胞凋亡,可抑制宫颈癌细胞中抑癌蛋白p53与泛素蛋白连接酶E6AP相互作用,降低p53泛素化修饰水平,延缓p53降解,增加p53蛋白表达水平。结论NC可通过抑制p53泛素化降解,提升p53蛋白表达水平,恢复其抑癌功能,发挥抗宫颈癌作用。

中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞P53泛素化降解途径的实验研究

目的从细胞生物学及分子生物学水平探讨中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞增殖抑制及P53泛素化降解途径中各个蛋白表达的情况,研究中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞生长的调节作用。方法以4%含药血清培养液作用于SiHa细胞,设立正常对照组、空白血清组、清毒栓组及保妇康组、安达芬组,通过MTT法检测含药血清对细胞增殖抑制的影响;同时运用Western-Blot的方法检测HPV16E6、P53、UBcH8、E6-AP蛋白的表达情况。结果经含药血清培养液作用后各组细胞数量减少,其中以4%浓度含药血清作用72h时对细胞抑制作用最强,与空白血清组比较,差异有统计学意义(P<0.01);同时含药血清可升高P53、UBcH8蛋白的表达,降低HPV16E6、E6-AP的表达。结论清毒栓含药血清可能是通过调控P53泛素化降解途径而达到抑制肿瘤的目的。

Cullin5介导PD-L1泛素化降解对胶质母细胞瘤放射敏感性的影响

目的探究Cullin5对胶质母细胞瘤细胞放射敏感性的影响及其相关机制。方法将flag-NC质粒、过表达(flag-Cullin5)质粒分别转染至胶质母细胞瘤U251细胞,建立flag-NC组、flag-Cullin5组,通过实时反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测细胞中Cullin5和程序性死亡配体1(PD-L1)的mRNA和蛋白表达水平。U251细胞接受0、2、4、8 Gy X线照射后,通过CCK-8法检测细胞存活率,通过流式细胞术检测细胞凋亡率。采用免疫共沉淀法检测Cullin5和PD-L1的相互作用,泛素化实验探究Cullin5对PD-L1的泛素化效应。将过表达PD-L1(oe-PD-L1)和flag-Cullin5的质粒转染至U251细胞,建立flag-Cullin5组、flag-Cullin5+oe-NC组和flag-Cullin5+oe-PD-L1组,通过RT-qPCR和WB检测细胞中Cullin5和PD-L1的mRNA和蛋白表达水平。经X线照射各组U251细胞后,通过CCK-8法检测细胞存活率,通过流式细胞术检测细胞凋亡率。采用LSD-t检验或单因素方差分析统计两组间或多组间差异。结果与flag-NC组比较,flag-Cullin5组细胞中Cullin5 mRNA和蛋白表达水平升高,PD-L1蛋白表达水平降低(P<0.05);经4、8 Gy X线照射后,细胞存活率降低,细胞凋亡率升高(P<0.05)。Cullin5的免疫沉淀物中存在PD-L1蛋白,PD-L1的免疫沉淀物中存在Cullin5蛋白。与flag-NC组比较,flag-Cullin5组细胞中PD-L1蛋白泛素化水平升高。与flag-Cullin5组比较,flag-Cullin5+oe-PD-L1组细胞中PD-L1 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05);经4、8 Gy剂量的X线照射后,细胞存活率升高,细胞凋亡率降低(P<0.05)。结论Cullin5通过介导PD-L1的泛素化降解,增强胶质母细胞瘤细胞的放射敏感性。

基于疏水标签的Bcl-2/Mcl-1蛋白泛素化降解剂

Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1是重要的抗肿瘤靶标。本研究以一个非选择性的Bcl-2家族蛋白抑制剂为基础,设计合了4种不同结构的基于疏水标签的Bcl-2/Mcl-1蛋白泛素化降解剂S1-D1~S1-D4,在乳腺癌细胞模型MCF-7上考察了其诱导Bcl-2和Mcl-1蛋白泛素化降解和肿瘤细胞凋亡的能力。结果显示,尽管S1-D1~S1-D4均保持了对Bcl-2家族蛋白广谱的亲和力,但引入不同的连接子导致S1-D1~S1-D4实现了对Bcl-2和Mcl-1的选择性降解。其中,具有疏水烷基链的S1-D2分子对Bcl-2的降解能力最强,加入3μmol·L^(-1)时能够降解超80%的Bcl-2蛋白,而具有聚乙二醇链连接子的化合物S1-D4则表现出对Mcl-1蛋白的特异性降解,加入3μmol·L^(-1)时降解了约60%的Mcl-1蛋白。细胞毒性实验证明基于疏水标签的蛋白降解剂能够通过诱导靶蛋白的降解获得更强的肿瘤细胞杀伤活性,揭示了降解剂相比于抑制剂分子的优势。

间歇运动降低炎症和蛋白泛素化降解改善心梗导致的大鼠骨骼肌萎缩

目的:探讨间歇运动及间歇运动联合TNF-α抑制剂Etanercept对心梗大鼠骨骼肌MuRF1和Smyd1表征的影响及炎症水平与骨骼肌功能改善的关系。方法:雄性3月龄SD大鼠70只,随机分为假心梗组(S)、心梗组(MI)、心梗+间歇运动组(ME)、心梗+Etanercept组(MIT)、心梗+生理盐水组(MIS)、心梗+间歇运动+Etanercept组(MET)、心梗+间歇运动+生理盐水组(MES),每组10只。采用左冠状动脉结扎法制备心梗模型,S组只在心脏相同位置穿线不结扎。ME组、MET组和MES组术后1周采用大鼠跑台进行间歇运动干预。其中MIT组和MET组于术前3 d腹腔注射Etanercept(1. 2μg/g) 1次,术后i. p. 1次/3 d×4周,MIS组和MES组注射定量生理盐水作为参照。各组训练结束后次日腹腔麻醉,测定心脏功能,之后冰浴条件下快速剥离并切取胫骨前肌,入甲醛固定或液氮冷藏备用。胫骨前肌重量/胫骨长度比值测定骨骼肌质量变化,免疫荧光测定骨骼肌HSP70和骨架蛋白Myosin表达变化及细胞横截面积,RT-qPCR测定骨骼肌MuRF1和MAFbx mRNA基因表达变化,Western blot测定骨骼肌MuRF1、MAFbx、Smyd1、HSP90、TNF-α、NF-κB(pp65)、IL-6、IL-10、HSP70、Myosin和α-actinin蛋白表达变化,糜蛋白酶活性试剂盒检测骨骼肌蛋白酶体活性变化。结果:心梗导致大鼠骨骼肌质量系数、细胞横截面积、细胞骨架蛋白Myosin和α-actinin及肌纤维生成关键因子Smyd1表达显著降低(P <0. 01),MuRF1、MAFbx、TNF-α、IL-6、NF-κB(pp65)和伴侣分子HSP90表达显著升高(P <0. 01),间歇运动或Etanercept干预以及2者联合干预均可显著提高心梗大鼠骨骼肌质量系数、细胞横截面积、IL-10、Myosin、α-actinin和Smyd1蛋白表达(P <0. 05,P <0. 01),降低MuRF1、MAFbx、TNF-α、IL-6、NF-κB(pp65)和HSP90水平(P <0. 05,P <0. 01);心梗大鼠骨骼肌的细胞浆和细胞核MuRF1蛋白表达显著升高(P <0. 05,P <0. 01),糜蛋白酶活性增加(P <0. 01),间歇运动可进一步升高其胞浆和胞核HSP70表达(P <0. 01),降低MuRF1蛋白表达、细胞浆/细胞核HSP70比值和糜蛋白酶活性(P <0. 05,P <0. 01),且机体炎症水平与细胞浆/细胞核HSP70比值呈显著正相关(P <0. 01)。结论:间歇运动或Etanercept干预或2者的共同干预均可显著提高心梗大鼠骨骼肌质量、骨架蛋白和Smyd1的表达,增加细胞横截面积,降低MuRF1、MAFbx和HSP90的表达,改善骨骼肌功能。

E3泛素连接酶接头蛋白SPOP介导的底物非降解型泛素化修饰

蛋白质的翻译后修饰是保证其能正常行使功能的前提,泛素化修饰是维持细胞正常蛋白质水平和活性的重要翻译后修饰类型。近年来,大量研究发现,E3泛素连接酶斑点型锌指结构蛋白(speckle-type POZ protein,SPOP)在诸多肿瘤与遗传疾病中存在突变,这些突变主要集中在识别底物的MATH结构域影响了与底物之间的结合,进而影响底物的蛋白质水平、定位及活性,并扰乱正常生理功能从而诱发疾病。野生型SPOP能正常结合底物,这些底物绝大多数由SPOP泛素化后进入蛋白酶体途径降解,而也有个别重要底物泛素化后仅是影响其功能改变而并非蛋白质水平的变化。鉴于SPOP在细胞内的重要功能,本文将对SPOP的底物泛素化修饰类型及功能进行详细介绍。包括:泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS),SPOP的结构、功能和作用途径以及SPOP的非降解型泛素化修饰。重点围绕SPOP的3个非降解底物:髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88)介导的NF-κB信号通路、组蛋白macroH2A1(macroH2A.1 histone,macroH2A1)的X染色体沉默信号通路,以及成蛋白INF2(inverted formin 2)介导的线粒体分裂融合等信号通路,将其抑制肿瘤发生发展的分子机制进行总结,以期为肿瘤精准靶向治疗提供新思路。

泛素蛋白连接酶MDM2活性及稳定性调控的研究进展

泛素蛋白连接酶MDM2(Murine double minute 2)具有癌基因活性,MDM2高表达会导致抑癌基因p53失活而诱发肿瘤,但在至少7%的肿瘤中p53基因正常而mdm2异常扩增,表明MDM2还具有其他底物分子,以p53不依赖的方式促进肿瘤的发生。鉴于MDM2的重要作用,文章在基因水平、转录水平、翻译后修饰水平、相互作用分子的调节等方面系统总结了目前对MDM2调控的主要研究机制及其进展。

PLEK2通过c-Myc介导的正反馈回路促进头颈鳞状细胞癌发生发展及干性形成

背景与目的头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是全球高发的恶性肿瘤之一,具有预后不良、淋巴结转移率高以及早期复发的特点。然而,调控HNSCC发生发展的分子机制尚未明确。因此,揭示其潜在机制以寻找有治疗前景的新靶点具有重要意义。本研究主要探讨PLEK2(pleckstrin-2)在调控HNSCC发生发展中的作用。方法通过分析独立公共数据集以及内部队列,确定PLEK2在HNSCC表达情况及其临床意义。同时,使用体内外实验,包括细胞增殖、集落形成、Matrigel侵袭、肿瘤球形成、ALDEFLUOR检测、蛋白印迹分析,以及异种移植小鼠模型等方法,明确PLEK2在调控HNSCC细胞恶性生物学行为中的作用。另外,通过免疫共沉淀、环己酮霉素追踪分析、泛素化实验、染色质免疫沉淀–定量聚合酶链反应、荧光素酶报告基因实验和挽救实验等方法,阐明PLEK2在促进肿瘤发展中的潜在分子机制。结果在HNSCC组织中,PLEK2 mRNA和蛋白质表达水平较正常组织明显增加;PLEK2的过度表达与不良预后和治疗抗性显著关联。此外,PLEK2在维持HNSCC细胞的增殖、侵袭、上皮间质转换、癌症干细胞特征和肿瘤形成中发挥重要作用,并能改变癌细胞的代谢。在分子机制方面,PLEK2能与c-Myc结合,降低FBXW7(F-Box And WD Repeat Domain Containing 7)与c-Myc的相互作用,避免了c-Myc的泛素化和随后的蛋白酶体介导的降解。更进一步,PLEK2激活的c-Myc信号对于维持HNSCC细胞的恶性生物学行为至关重要。此外,c-Myc可结合到PLEK2启动子并促进其转录,形成了正反馈循环。结论我们揭示了PLEK2通过调控c-Myc促进HNSCC发生发展的分子机理,表明PLEK2可能成为HNSCC的潜在治疗靶点。

CacyBP/SIP研究进展

1996年,Filipek等从艾氏腹水瘤细胞中发现了一种30kDa的蛋白质,它可与钙周期素（calcyclin,又名S100A6）结合,故此命名为钙周期素结合蛋白（calcylin binding protein,

EndophilinA2维持血压稳态作用及机制

目的观察EndophilinA2对小鼠血压的影响并探讨其分子机制.方法：采用植入式遥测技术测定小鼠血压.血管环实验测定小鼠胸主动脉血管收缩和舒张反应.WesternBlot和PCR检测蛋白和mRNA表达,激光共聚焦显微镜和免疫共沉淀检测蛋白-蛋白相互作用,ELISA方法测定内皮细胞总硝基化合物及cGMP的含量.结果EndophilinA2基因敲除小鼠基础血压明显升高,胸主动脉血管内皮依赖性舒张反应减弱,而收缩反应无明显变化.EndophilinA2转基因小鼠则抑制血管紧张素II引起的血压升高,并改善内皮舒张功能障碍.EndophilinA2缺失促进Itch介导的eNOS泛素化降解;相反,过表达EndophilinA2则抑制eNOS降解.进一步研究显示EndophilinA2、eNOS以及Itch三者间存在相互作用,且EndophilinA2和Itch竞争性结合于eNOS645-850位氨基酸区域.结论EndophilinA2是抑制Itch介导eNOS蛋白降解的关键分子,提示EndophilinA2是维持血管内皮舒张功能和血压稳定的新干预靶点.

PDGF-BB下调血管平滑肌标志物SM22α表达的机制

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型转化是血管重塑性疾病的细胞病理学基础,血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)-BB抑制平滑肌分化标志基因表达、加速其降解,是VSMC表型转化的关键。该研究用PDGF-BB刺激VSMC诱导细胞发生表型转化,利用Western blot和免疫共沉淀等技术,检测PDGF-BB对早期分化相关基因平滑肌22 alpha(smooth muscle 22 alpha,SM22α)磷酸化与泛素化的影响。实验结果显示,PDGF-BB促进VSMC增殖;上调增殖相关蛋白PCNA的表达,下调分化相关蛋白SM22α与SMα-actin的表达;诱导SM22α发生磷酸化和泛素化,而且,该过程与SM22α水平下调具有时相相关性;抑制剂阻断分析证实,ERK和PKC参与介导了PDGF-BB诱导的SM22α磷酸化。以上结果提示,在VSMCs表型转化中,PDGF-BB可能是通过激活ERK-PKC信号通路,促进SM22α的磷酸化和泛素依赖的蛋白质降解。

荷载白细胞介素-24条件增殖腺病毒诱导黑色素瘤细胞凋亡的机制

目的 探讨荷载白细胞介素（IL）-24的条件增殖腺病毒ZD55-IL-24诱导黑色素瘤细胞凋亡的分子机制.方法 ZD55-IL-24感染人黑色素瘤A375细胞.Western blot和免疫沉淀技术检测细胞的IL-24、B淋巴细胞瘤/白血病-2（bcl-2）亚硝基化、bcl-2泛素化、bcl-2蛋白表达水平及半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase）蛋白活性;加入不同浓度的一氧化氮（NO）调节剂改变bcl-2亚硝基化水平,检测其对bcl-2泛素化水平和Caspase蛋白活性及黑色素瘤细胞凋亡的影响.结果 ZD55-IL-24导致A375细胞bcl-2亚硝基化水平下调,泛素化水平上调,bcl-2蛋白水平下降,Caspase 信号通路激活,黑色素瘤细胞凋亡,在作用72 h后细胞凋亡达高峰,细胞凋亡率由对照组的11％上升到72％;NO供体SNP可促进bcl-2亚硝基化、抑制bcl-2泛素化水平从而上调bcl-2蛋白水平,细胞凋亡率由68％下降到19％;SNP拮抗剂DTT则加速ZD55-IL-24介导的肿瘤细胞凋亡,细胞凋亡率上升到93％;NO清除剂PTIO也同样促进黑色素瘤细胞的凋亡,细胞凋亡率上升到85％.结论 IL-24通过抑制bcl-2亚硝基化促进其泛素化降解,导致黑色素瘤细胞凋亡.

S期激酶相关蛋白2对恶性肿瘤发展及预后影响的研究进展

SKP2属于F-box蛋白家族,参与蛋白质泛素化降解过程,可以调控细胞周期、凋亡及衰老,具有癌基因的潜能。该文介绍了SKP2的基本结构功能,并阐述了SKP2对乳腺癌、前列腺癌、食管癌发生发展的促进作用,提示了SKP2是潜在的恶性肿瘤治疗靶点。

BTB蛋白结构与功能研究进展

BTB(Broad-complex, Tramtrack, and Bric-a-brac)蛋白家族存在于痘病毒以及几乎所有真核生物中,该类蛋白为多结构域蛋白,最为显著的特征是含有高度保守且能介导蛋白与蛋白间相互作用的BTB结构域。BTB蛋白具有多种功能,其功能特异性取决于BTB蛋白中其他结构域以及它的互作蛋白。BTB蛋白广泛参与转录调节,染色质重组装,细胞骨架调控和泛素化降解等过程,与胚胎发育,器官形成,信号转导以及免疫调节等生理过程密切相关。除此之外,多种疾病如癌症,神经系统和骨骼肌系统疾病等的病理过程也与BTB蛋白相关。本文以蛋白结构为基础总结了该家族的共性规律并重点论述了BTB蛋白在转录调节以及泛素化降解过程中发挥的重要作用,以期为后续研究提供重要参考。

hsa-miR-5688在肝细胞癌中靶途径预测体系的构建与验证

目的构建并预测在原发性肝细胞癌(肝癌)中hsa-miR-5688的靶途径及调控机制,并通过TCAG数据库和串联质量标签(TMT)标记LC-MS/MS蛋白质测序方法验证其结果,以期构建准确高效的微小RNA(miRNA,miR)靶途径预测方案。方法通过五大线上数据库筛选hsa-miR-5688靶基因,对细胞定位、分子功能、信号通路、疾病、组织表达和基因互作进行富集分析,构建分析策略,预测其靶途径及调控机制。利用TCAG数据库分析调控途径中靶基因的mRNA表达量、突变频率和生存曲线;基于肝癌复发和预后良好的肝癌组织标本,应用TMT标记蛋白质结合LC-MS/MS方法对靶途径中的互作蛋白进行定量检测,以验证预测体系的正确性。结果预测获得hsa-miR-5688调控的靶基因,包括信使RNA(mRNA)3031个,环状RNA(circRNA)1511个;代谢通路、细胞定位、分子功能、疾病、组织表达等富集结果经多重分析发现,靶基因RHOBTB1和UBE2W共同参与的泛素化蛋白降解途径是其调控肝癌进程的最关键信号通路。TCAG临床数据分析表明,泛素化途径的靶基因mRNA表达量在肝癌组织中明显高于正常肝组织,且基因突变会明显降低患者生存率。TMT标记蛋白质结合LC-MS/MS分析表明,与RHOBTB1和UBE2W互作的蛋白质泛素化降解相关基因UBA5、NEDD4L、UBE3C和USP14直接参与肝癌复发调控。结论hsamiR-5688可通过泛素化蛋白降解途径参与肝癌发生和复发进程,证明通过优化生物信息学构建快速预测miRNA靶途径的体系具有一定的高效性和准确性。