中华大蟾蜍精巢组织全长cDNA文库的构建及泛素延伸蛋白基因Bg-ubi52的获得

运用SMART技术构建了中华大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans）精巢全长cDNA文库。提取中华大蟾蜍精巢总RNA，用Clontech公司SMART^TM cDNA文库构建试剂盒反转录合成第一链cDNA，LD-PCR扩增获得全长cDNA双链；经SfiⅠ酶切、层析柱分离后，500bp以上的片段与λTriplEx2载体连接并包装，建成原始文库。经鉴定，原始文库滴度为2．21×10^6pfu／ml，重组率为91％；文库扩增后的滴度为2．94×10^9pfu／ml，重组率为93．7％。插入片段大小分布于0．4～2．0kb之间，平均长度约为1．0kb，说明已构建文库质量较高，为进一步筛选、克隆精巢特异表达基因奠定了基础。从该文库中克隆到了泛素延伸蛋白基因，全长561bp，包含完整的5′和3′非编码区，编码128个氨基酸，即泛素的76个氨基酸后融合了52个氮基酸的核糖体L40蛋白。

牡丹泛素延伸蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的:利用巢式PCR技术克隆牡丹泛素延伸蛋白基因,为泛素蛋白降解系统研究奠定基础,也为牡丹基因表达水平研究提供内参基因。方法:从牡丹(Paeonia suffruticosa)叶片、花瓣、花萼中提取总RNA,反转录得到cDNA,根据已报道的泛素延伸蛋白基因设计巢式引物进行PCR扩增。结果:得到一条389bp的牡丹泛素延伸蛋白基因片段,该片段编码129个氨基酸残基。结论:通过Blastn比对分析表明:牡丹泛素延伸蛋白基因与番茄、水稻、拟南芥等植物的泛素延伸蛋白基因一致性达到100%,编码的氨基酸序列同源性达94%以上。确认该片段即牡丹泛素延伸蛋白基因。

桑泛素延伸蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的:利用3’RACE技术克隆植物泛素基因,是进一步研究其功能的基础。方法:本研究从桑树(丰驰桑)(Morus bomby-cis)幼叶中提取总RNA,反转录成cDNA,根据已报道的泛素基因序列设计1条正向引物,利用3’RACE(Rapid Amplification of cDNAEnd)技术进行扩增。结果:扩增出1条690 bp的泛素基因片段。该片段5’端为编码156个氨基酸残基的阅读框,3’末端有219bp的非翻译区。结论:同源分析表明,此cDNA序列为泛素延伸蛋白基因(Genebank登录号为DQ839403)。用Genedoc软件对该片段编码的氨基酸序列进行同源性分析的结果表明:桑树泛素延伸蛋白与马铃薯、烟草、陆地棉、黄瓜的泛素延伸蛋白以及苜蓿的核糖体S27A蛋白的同源性都在96%以上。

毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白基因克隆及序列分析

目的:该文首次从毛尖紫萼藓中克隆到泛素延伸蛋白基因的全长,为深入研究其功能打下基础。方法:提取植物的总RNA,经反转录得到cDNA,根据实验室得到的毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白基因的EST序列设计引物,基于3’RACE(Rapid Ampli-fication of cDNA End)技术克隆得到全长序列,使用分子生物学软件进行序列分析。结果:获得了cDNA全序列,GenBank登录号为JQ659260,序列全长为673bp,开放阅读框为471 bp,编码156个氨基酸残基。结论:通过Blast P对其编码的氨基酸序列进行比对结果显示:毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白与小立碗藓、北美云杉、葡萄、蓖麻、毛果杨、紫茎泽兰的泛素延伸蛋白的同源性均在96%以上。

牡丹5个管家基因的克隆及其在系统进化分析中的应用

利用RT-PCR技术从牡丹组7个野生种和1个栽培种中分别克隆得到泛素延伸蛋白基因（ubiquitin，UBI）、素环蛋白基因（cyclophilin，CYP）、肌动蛋白基因（Aetin）、葡萄糖六磷酸脱氢酶基因（glucose．6-phosphatel-dehydrogenase，G6PD）和β-微管蛋白基因（beta-tubulin，TUB）等5个管家基因的编码序列（codingsequence，CDS）。