泛素特异性蛋白酶4对透明细胞肾细胞癌细胞增殖能力的影响

目的探讨人类泛素特异性蛋白酶4(USP4)对透明细胞肾细胞癌(KIRC)细胞增殖能力的影响。方法从TCGA数据库及GEO数据库中下载KIRC患者的基因表达及临床信息资料,进行转化及整理;同时利用Ualcan、HPA数据库等在线工具对数据库中的KIRC患者进行进一步分析,研究USP4表达与KIRC患者临床病理特征(包括TNM分期和病理分级)以及生存预后的关系。在KIRC细胞株Caki-1、OSRC-2中转染USP4干扰和过表达质粒,通过平板克隆、细胞计数试剂盒8实验检测USP4对KIRC细胞增殖能力的影响。结果生物信息学分析显示,USP4在KIRC组织中的mRNA及蛋白表达水平均明显低于癌旁正常肾脏组织(均P<0.05)。KIRC组织中USP4 mRNA表达水平与患者肿瘤T分期、病理分期、组织学分级、总生存率、疾病特异性生存率、无进展生存率均有关(均P<0.05);与性别、年龄、N分期、M分期均无关(均P>0.05)。细胞实验结果显示,USP4蛋白在Caki-1、OSRC-2细胞中显著过表达,而过表达USP4会明显降低Caki-1、OSRC-2细胞增殖能力和克隆形成能力(均P<0.05);敲低USP4会明显提高Caki-1细胞克隆形成能力(均P<0.05)。结论USP4在KIRC组织中低表达,而过表达USP4可抑制KIRC细胞增殖能力。

子宫颈鳞状细胞癌组织中泛素特异性蛋白酶4和基质金属蛋白酶2的表达及意义

目的观察宫颈鳞状细胞癌及癌旁正常宫颈组织中泛素特异性蛋白酶4(USP4)和基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达,探讨两者在宫颈鳞状细胞癌发生、发展中的作用及相关性,并分析两者与各临床病理因素的关系。方法收集常州市金坛区人民医院病理科2010年1月至2013年12月70例宫颈鳞状细胞癌组织及癌旁组织,采用免疫组化检测USP4和MMP2的表达。结果 USP4和MMP2在宫颈鳞状细胞癌中的表达率分别为61.4%,44.3%,而在癌旁组织中的表达分别为8.0%,4.3%。它们在有淋巴结转移的宫颈癌组织中表达率分别为80.0%,90.7%,在无淋巴结转移的宫颈癌组织的表达分别为47.5%,56.1%。在浸润深度≥1/2间质的宫颈癌组织中的表达分别为62.2%,83.8%,在<1/2间质的宫颈癌组织中的表达为29.2%,37.5%,与淋巴结转移及浸润深度呈正相关(P<0.05),但与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级无关(P>0.05)。且USP4和MMP2在宫颈鳞癌组织中的表达呈正相关(P<0.05)。结论 USP4和MMP2表达可能与宫颈鳞状细胞癌的发生发展有关,可作为预后判断和治疗指导的参考指标之一。

肠道病毒71型2A蛋白酶通过切割宿主蛋白泛素特异性蛋白酶4促进病毒的复制

目的探讨肠道病毒71型(EV71)2A蛋白酶与宿主蛋白泛素特异性蛋白酶4(USP4)在EV71感染中的作用。方法实时荧光定量PCR检测EV71感染人横纹肌肉瘤细胞(RD)后USP4 mRNA表达水平,western blot检测VP1及USP4蛋白;通过敲减宿主细胞USP4,观察VP1 mRNA的表达和病毒滴度水平;通过过表达2A蛋白酶,研究宿主细胞USP4蛋白的切割原因。结果荧光定量PCR结果表明,EV71感染8 h时USP4 mRNA的表达水平开始降低(0 h、8 h分别为1.03±0.04和0.83±0.02,t=4.50,P<0.05);western blot结果表明,EV71感染8 h时USP4的蛋白质表达水平降低(0 h、8 h分别为1.25±0.01和0.51±0.02,t=57.32,P<0.05)并出现切割条带;敲除宿主细胞USP48 h后,与对照组(1.48±0.08)相比,实验组VP1 mRNA表达水平(3.66±0.08)明显升高(t=17.51,P<0.05);病毒滴度检测结果发现,与对照组病毒滴度[(8.20±0.17)×105 PFU/mL]比较,siRNA1敲除组病毒滴度[(10.55±0.29)×105 PFU/mL]升高,差异有统计学意义(t=6.98,P<0.05)。过表达2A蛋白酶,宿主蛋白USP4出现切割条带。结论USP4参与抗病毒免疫反应,可能正向调节抗病毒信号通路;EV71可通过2A蛋白酶切割宿主细胞蛋白USP4从而逃逸免疫应答,促进病毒的复制。

泛素特异性蛋白酶4对脂肪干细胞成骨分化的影响

目的:本研究通过使用泛素特异性蛋白酶4(USP4)抑制剂Vialinin A干预大鼠脂肪干细胞(ASCs)的生长分化,探究USP4对ASCs的成骨分化的影响。方法:将分离培养至第3代的ASCs细胞分为6组分别用含0、0.1、0.5、1、5、10μmol/L Vialinin A的培养基培养10 d,CCK-8检测各组细胞增殖情况。将第3代细胞分为实验组、阳性以及阴性对照组,分别用含0.5μmol/L Vialinin A的成骨诱导液、不含Vialinin A的成骨诱导液及普通的α-MEM培养。检测各组第7天细胞内USP4、β-catenin、碱性磷酸酶(ALP)及骨桥蛋白(OPN)基因的表达。将3组细胞培养至第4、7、10、14天进行ALP染色,检测ALP的活性;培养至21 d时进行茜素红染色,检测细胞矿化结节的形成。采用t检验比较组间数据差异,P<0.05时差异具有统计学意义。结果:0.5μmol/L Vialinin A处理的实验组细胞增殖趋势与对照组的差异无统计学意义,表明该浓度的Vialinin A对细胞增殖无影响,作为后续实验组浓度。ALP与茜素红染色结果显示实验组染色效果均较其他组显著。RT-qPCR结果显示与阴性对照组相比,阳性对照组与实验组细胞内USP4与β-catenin表达量较低,差异具有统计学意义。实验组与阳性对照组相比无显著性差异。与阳性对照组相比,实验组的ALP与OPN表达量显著升高,差异具有统计学意义。结论 :0.5μmol/L的USP4抑制剂Vialinin A可以促进大鼠ASCs内ALP与OPN基因的表达。但USP4可能并非通过β-catenin途径调节其成骨分化。

泛素特异性蛋白酶4对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

目的探讨泛素特异性蛋白酶4(USP4)对增生性瘢痕(HS)成纤维细胞增殖的影响。方法体外培养人HS成纤维细胞(HSFB),并取第4代细胞用于试验。利用Vialinin A(USP4抑制剂)干预HS成纤维细胞,Western blot检测干预细胞中不同时间段(0、12、24、48h)USP4、TβRI及Smad7蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测Vialinin A对HS成纤维细胞增殖的影响,分为试验组和对照组(不作干预)。结果 Vialinin A作用后,随着时间推移,HSFB中的USP4蛋白表达逐渐减低,TβRI的蛋白也逐渐减低,在作用12h后明显降低(P<0.05);Smad7的蛋白表达则逐渐升高(P<0.05)。Vialinin A同一浓度作用后,随着时间推移,HSFB增殖活性逐渐受到抑制,试验组与对照组同一时间段比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论USP4可能通过调控TGF-β/Smad信号通路影响瘢痕细胞增殖,抑制其表达可使HS成纤维细胞增殖减慢。

长链非编码RNA核富集转录本1对瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡和迁移的影响

背景:已有研究阐明核富集转录本1(nuclear enriched abundant transcript 1,NEAT1)下调抑制了瘢痕成纤维细胞的进展,但具体机制尚不完全清楚。目的:探讨长链非编码RNA NEAT1调节miR-136-5p/泛素特异性蛋白酶4(ubiquitin specific protease 4,USP4)轴对瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响。方法:将瘢痕成纤维细胞分为5组:si-NC组、空白对照组、si-NEAT1组、si-NEAT1+miR-136-5p inhibitor组、si-NEAT1+inhibitor-NC组,qRT-PCR检测NEAT1、miR-136-5p表达;CCK-8法及EDU染色检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;划痕愈合实验检测细胞迁移情况;Western blot检测USP4、p27、Bax、基质金属蛋白酶9、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白α1链蛋白表达;双荧光素酶实验检测NEAT1与miR-136-5p、miR-136-5p与USP4的关系。结果与结论:①与si-NC组比较,si-NEAT1组NEAT1表达、A450值、EDU阳性细胞百分比、划痕愈合率以及USP4、基质金属蛋白酶9、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白α1链蛋白表达降低(P<0.05),miR-136-5p表达、细胞凋亡率及p27、Bax蛋白表达升高(P<0.05);②miR-136-5p inhibitor逆转了沉默NEAT1对瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响;③miR-136-5p与NEAT1、miR-136-5p与USP4存在靶向调控关系。结果表明,沉默NEAT1可能通过调控miR-136-5p/USP4轴抑制瘢痕成纤维细胞的增殖和迁移,诱导其凋亡。

USP4通过去泛素化转化生长因子-βⅠ型受体调控乳腺癌细胞的生物学活性

目的观察泛素特异性蛋白酶USP4对转化生长因子-βⅠ型受体（TGFβRI）的去泛素化调节及其对乳腺癌细胞生物学活性的调控。方法通过慢病毒感染构建过表达USP4的稳定乳腺癌细胞株BT-549。在乳腺癌细胞中表达外源性泛素，通过泛素化实验验证USP4对TGFβRI的泛素化修饰。采用克隆形成实验和划痕实验检测USP4对乳腺癌细胞克隆形成能力、迁移能力的影响。结果过表达USP4的稳定乳腺癌细胞株中USP4mRNA的表达量（△Ct=3．43±0．05）是空白对照细胞（△Ct=7．26±0．03）的14．22倍，差异有统计学意义（t=69．350，P=0，000）；USP4蛋白的表达量是空白对照细胞的4．99倍，差异有统计学意义（t=28．440，P=0．000）。过表达USP4后TGFβ3RI的体外泛素化水平明显降低。在克隆形成实验中，稳定过表达USP4、病毒对照及空白对照的BT-549细胞克隆形成率分别为（25．83±1．01）％、（11．83±0．60）％、（7．17±0．60）％，分别t=11．880、15．840，差异有统计学意义（P=0．000）。在划痕试验中，放大200倍视野下观察稳定过表达USP4、病毒对照及空白对照的BT-549细胞，每个视野可见发生迁移的细胞个数为（56．67±1．76）、（27．00±1．16）、（27．33±1．45）个，t=14．070、12．840，差异有统计学意义（P=0．000）。结论USP4可通过其去泛素化酶的活性解除TGFβRI耦联的泛素链稳定TGFβRI的表达，从而增强乳腺癌细胞的生物学活性。

基于RLR信号通路的去泛素化酶对EV71感染的调控机制研究

目的探讨基于维甲酸诱导基因Ⅰ样受体(RLR)信号通路的去泛素化酶对肠道病毒71型(EV71)感染的调控机制。方法将人横纹肌肉瘤细胞A-204分为空白对照组、空载质粒组、去泛素化酶组,空白对照组不作任何处理,空载质粒组转染10 nmol/L空载质粒48 h后加入EV71(MOI=0.5),去泛素化酶组转染10 nmol/L去泛素化酶USP4过表达质粒48 h后加入EV71(MOI=0.5)。采用RT-PCR检测各组细胞中EV71 mRNA表达,Western blot检测各组细胞USP4、维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)、LGP2蛋白表达。结果空载质粒组细胞USP4蛋白表达明显低于空白对照组(P<0.05),去泛素化酶组细胞USP4蛋白表达明显高于空载质粒组和空白对照组(P<0.05)。空载质粒组和去泛素化酶组细胞EV71 mRNA表达明显高于空白对照组(P<0.05),去泛素化酶组细胞EV71 mRNA表达明显低于空载质粒组(P<0.05)。空载质粒组细胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表达明显低于空白对照组(P<0.05),去泛素化酶组细胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表达明显高于空载质粒组和空白对照组(P<0.05)。结论去泛素化酶USP4可能通过激活RLR信号通路而发挥抗EV71感染作用。