泛素特异水解酶22基因RNA干扰真核表达载体的构建及鉴定

目的构建泛素特异水解酶22基因(USP22)RNA干扰(RNAi)的真核表达载体,并观察其对肝癌细胞株HepG2增殖的影响。方法根据USP22 mRNA序列,合成两条寡聚DNA片段,退火后克隆入质粒载体pMSCV/Hyg/U6。酶切和测序鉴定重组质粒pMSCV/Hyg/siUSP22。脂质体介导重组质粒转染HepG2细胞,RT-PCR和Western blot检测USP22基因mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测细胞增殖能力。结果经酶切鉴定筛选出的重组质粒测序结果与目的序列完全一致。该重组质粒转染能降低HepG2细胞USP22 mRNA及蛋白质表达,并抑制细胞增殖。结论成功构建USP22基因RNAi真核表达载体,该载体通过下调USP22基因表达,抑制HepG2细胞的增殖能力,为进一步研究USP22的生物学功能奠定了基础。

USP22 aiRNA通过Mdm2-p53通路抑制膀胱癌耐药细胞株T24/MMC的增殖

目的研究沉默泛素特异肽酶22（USP22）基因对膀胱癌T24丝裂霉素C（mitomycin C,MMC）耐药细胞株（T24/MMC）生长活性的影响,并探讨其可能的作用机制。方法采用MTT法检测不同浓度的MMC（20、40、80、160、320μg/mL）对T24和T24/MMC细胞生长活性的影响。实时荧光定量PCR和Western blot法检测人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1细胞株、T24和T24/MMC细胞中USP22mRNA和蛋白的表达水平。采用非对称性小RNA（aiRNA）干扰技术沉默USP22,MTT法和吖啶橙/溴化乙啶（AO/EB）双重染色法分别检测沉默USP22后MMC对T24细胞、T24/MMC细胞生长活性和凋亡的影响。实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测p53和Mdm2mRNA和蛋白的表达水平。结果采用不同浓度的MMC（20、40、80、160、320μg/mL）处理细胞24h后,T24细胞的生长活性分别为82.4%、68.7%、44.2%、25.4%和4.7%,与未经MMC处理组比较差异均具有统计学意义（均P〈0.05）。然而,0~160μg/mL的MMC对T24/MMC细胞的生长活性无明显影响。与SV-HUC-1细胞比较,USP22在T24及T24/MMC细胞中高表达,且T24/MMC细胞中USP22表达显著高于T24细胞,差异具有统计学意义（P〈0.05）。沉默USP22后,MMC对T24细胞的生长活性抑制作用更显著。且当MMC浓度在20~160μg/mL时,沉默USP22后T24/MMC细胞的生长活性也明显受到抑制,其生长活性分别为85.1%、70.3%、63.2%和47.8%。同时,AO/EB实验结果显示,沉默USP22后给予80μg/mL的MMC处理24h,可诱导T24及T24/MMC细胞凋亡。实时荧光定量PCR和Western blot结果进一步显示,转染USP22aiRNA 24h后,T24/MMC细胞中p53基因的mRNA和蛋白表达水平上调,Mdm2表达水平下调。结论 USP22aiRNA通过调控Mdm2-p53通路增强MMC抑制T24细胞增殖的敏感性,同时也能够逆转T24/MMC对MMC的耐药。

泛素特异肽酶22基因通过Myc调控人膀胱癌EJ细胞增殖的机制研究

目的 研究非对称小干扰RNA（asymmetric structure of interfering RNA,aiRNA）沉默泛素特异肽酶22（ubiquitin specficpeptidase 22,USP22）基因对膀胱癌EJ细胞增殖的影响及其相关机制.方法 2010年8月至2012年3月,我们设计并合成USP22 aiRNA及阴性对照aiRNA（NC-aiRNA） USP22 aiRNA序列结构包括长度分别为15 bp和21 bp的正义链和反义链,将此aiRNA命名为USP22 aiRNA（15/21）,利用脂质体转染膀胱癌EJ细胞.实验分3组：对照组、NC-aiRNA组和USP22 aiRNA（15/21）组转染后48 h,通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹法分别检测USP22、Myc、cyclin D1和cyclin E1基因mRNA和蛋白表达水平,噻唑蓝（MTT）法检测EJ细胞的增殖活性,荧光素酶报告基因检测系统检测Myc启动子活性 利用染色质免疫共沉淀法（chromatin immunoprecipitation,ChIP）分析沉默USP22基因后转录因子Sp1与Myc基因启动子的结合情况结果 与对照组相比,转染USP22 aiRNA（15/21） 48 h后EJ细胞中的USP22、Myc、cyclin D1和cyclin E1的mRNA和蛋白表达水平分别下调了（87.4±5.2）％和（91.2±7.3）％、（69.2±4.3）％和（61.0±6.6）％、（78.5±4.1）和（67.4± 5.5）％、（81.0±5.5）％和（78.3±4.0）％（P＜0.05）.MTT结果显示,USP22aiRNA（15/21）组EJ细胞的增殖活性明显受到抑制,在24、48、72和96h4个时间点的细胞生长活性分别为（85.4±5.7）％、（71.3±8.4）％、（52.5±6.7）％和（45.8±6.4）％（P＜0.05）.荧光素酶报告基因检测结果显示,USP22 aiRNA（15/21）组Myc启动子的转录活性下调（65.5±4.2）％（P＜0.05）.ChIP结果进一步显示,沉默USP22抑制了转录因子Sp1与Myc启动子的结合,USP22 aiRNA（15/21）组Sp1与Myc启动子的结合能力相比对照组下调了（48.0±3.2）％（P＜0.05）.结论 USP22 aiRNA（15/21）可能通过抑制Myc基因启动子与转录因子Sp1的结合,下调Myc的表达,从而抑制膀胱癌EJ细胞的增殖.

非对称性小RNA干扰技术介导的USP22基因沉默的研究

目的 观察非对称小干扰RNA（aiRNA）对膀胱癌EJ细胞泛素特异肽酶22（USP22）基因的沉默效率及特异性的影响.方法 设计并合成USP22基因的小干扰RNA（siRNA）及aiRNA,利用脂质体Translipid转染EJ细胞,采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测转染前后EJ细胞USP22 mRNA的表达水平变化,比较USP22 siRNA与USP22 aiRNA对USP22基因沉默效率及特异性的差异.结果 浓度为50 nmol/L的15/21 USP22 aiRNA能明显抑制EJ细胞中USP22基因mRNA的表达,转染48 h后USP22 mRNA的表达水平下降到最低[（8.30±1.68）%,P＜0.05],且其沉默效率和特异性明显优于USP22 siRNA.结论 以非对称小RNA干扰技术为基础设计的USP22aiRNA能够有效沉默USP22基因,并且降低了非特异性的脱靶效应,减少了受RNA干扰中的＂饱和机制＂及＂竞争机制＂的影响,弥补了传统siRNA的一些不足.

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22，USP22）基因，构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段，依次插入真核表达载体pEGFP—N1；重组质粒转染HEK293T细胞，观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致，酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误，质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光，且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体，为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。

miR-34b抑制膀胱癌BIU-87细胞的增殖

目的:探讨微RNA-34b(microRNA-34b,miR-34b)对人膀胱癌BIU-87细胞增殖的影响及其可能的作用机制。方法:应用实时荧光定量PCR检测膀胱癌BIU-87细胞、人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1和人肾小管上皮细胞HK-2中miR-34b的表达水平。将miR-34b mimic转染至BIU-87细胞后,应用MTT法和克隆形成实验检测BIU-87细胞的增殖和克隆形成情况。miR-34b mimic与泛素特异肽酶22(ubiquitin-specific peptidase 22,USP22)-野生型(wide type,WT)或USP22-突变型(mutation type,Mut)重组载体共转染后,应用萤光素酶报告系统检测miR-34b是否与USP22基因3'-非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)结合。应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测miR-34b mimic转染后,BIU-87细胞中USP22 mRNA和蛋白的表达水平。结果:膀胱癌BIU-87细胞中miR-34b的表达水平低于肾小管上皮细胞HK-2和膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1(P值均<0.05)。miR-34b mimic转染后,BIU-87细胞的增殖率和克隆形成率低于空白对照组(BIU-87细胞未进行任何转染)和阴性对照组[BIU-87细胞转染miRNA mimic negative control(miRNA mimic NC)](P值均<0.05)。萤光素酶报告系统检测结果显示,miR-34b能特异性地与USP22基因3'-UTR结合,miR-34b mimic与重组载体USP22-WT共转染组细胞的萤光素酶活性下降(P<0.05)。miR-34b mimic转染组BIU-87细胞中USP22蛋白的表达水平低于空白对照组和阴性对照组(P值均<0.05)。结论:miR-34b可抑制膀胱癌BIU-87细胞的增殖,这一作用可能与USP22的表达有关。