泛素特异性蛋白酶7功能和在结直肠癌中的研究进展

泛素特异性蛋白酶7(ubiquitin-specific protease 7,USP7)是一种广泛参与各种细胞过程的去泛素化酶。USP7在调控细胞增殖与凋亡,细胞分裂、分化,DNA损伤修复,表观遗传学调控等生物学过程中有关键作用。本文对USP7的结构及其广泛的生物学功能进行综述。

泛素特异蛋白酶26基因多态性与男性不育关系的研究

目的泛素水平与精子数量的质量存在明显的相关。X染色体连锁的泛素特异蛋白酶26（USP26）基因在人类睾丸中特异表达，其变异与精子发生的关系存在争议。本研究旨在研究中国汉族男性USP26基因的多态性分布及其与男性不育的关系。方法用基因组DNA测序的方法分析221例不育男性（包括无精子症、弱精子症、少精子症和少弱精子症患者）和101正常生育男性的USP26基因全序列，分析其多态性和基因型在不同类型患者与生育对照之间的差异。结果本研究共发现6个变异位点：370—371insACA、494T〉C、508G〉A、576G〉A、1044T〉A和1423C〉T，对应的氨基酸改变分别为T123．124ins、L165S、G170R、E192E、F348L和H475Y。其中576G〉A（E192E）为同义突变，其氨基酸序列没有改变。508G〉A（G170R）为首次发现，其余5种变异在先前的研究中已有报道。与猕猴基因组比较发现370．371insACA和494T〉C为回复突变。576G〉A在正常生育组中高达78．2％，明显高于不育男性的49．1％（P〈0．01）；其余5个位点在不育和生育人群中没有明显差异（P〉0．05）。本研究共发现9种USP26基因型。在不育与生育人群的主要基因型有370insACA＋494C＋1423T、576A和576G型。576A和576G型在不育与生育人群中的分布存在明显差异（P〈0．01），而370insACA＋494C＋1423T型没有统计学差异（P〉0．05）。576A型在正常精子活力组明显高于低活力组（P〈0．05）；576G型在弱精子组明显低于正常生育男性对照（P〈0．01）；370insACA＋494C＋1423T型在不同精子密度和精子活力组间均没有明显差异（P〉0．05）。结论我国汉族人群中USP26基因370insACA＋494C＋1423T串突变与精子发生没有直接关系。USP26基因576G〉A位点的同义SNPs在不同精子活力组间有显著差异，576A可能有潜在的促进精子活力的作用。

泛素特异蛋白酶26基因多态性与特发性男性不育症的相关性研究

目的:研究泛素特异蛋白酶26(Usp26)基因多态性与特发性男性不育的关系及其在精子发生过程中的作用机制。方法:按照WHO标准(第4版)从150例不育患者中筛选出41例特发性不育患者,同时选取50例正常生育男性作为对照。采用PCR-SSCP法,从特发性不育患者中筛选突变样本,通过基因测序以确定突变方式和位点。结果:筛选出的41例特发性男性不育患者主要表现为精子浓度低、活动率差。基因测序分析结果显示:41例不育患者中9例(22.0%,P=0.01)存在Usp26基因的改变。其中,从8例(19.5%,P=0.01)患者中检测出复合突变:364位插入ACA和460位A置换了G;从1例(2.4%,P>0.05)患者中检测出1 044位A置换了T。以上3种变化均导致编码氨基酸的改变。50例正常生育男性均未发现该基因的突变。结论:Usp26基因的多态性可能与特发性男性不育症密切相关,且影响睾丸功能。

泛素特异蛋白酶24基因内含子rs12138592 A/G位点多态性与帕金森病的关系

目的探讨中国粤西地区汉族人群泛素特异蛋白酶24(USP24)基因内含子rs12138592A/G单核苷酸多态性与帕金森病(PD)的关系。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法测定81例PD患者(病例组)与100名健康成人(对照组)USP24基因内含子rs12138592A/G位点多态性。结果 病例组GG基因型为77.8%,对照组为62.0%(χ2=5.213,P=0.022)。G等位基因频率在病例组和对照组分别为88.3%和79.5%(χ2=4.980,P=0.026)。结论 USP24基因内含子rs12138592A/G位点的G等位基因与GG基因型均可以增加PD的患病风险。

USP10对KLF4蛋白的调控及对肝细胞癌侵袭的影响

目的探究泛素特异蛋白酶10(USP10)对肝细胞癌(HCC)中Krüppe样因子4(KLF4)蛋白的调控及对HCC细胞增殖与侵袭的影响。方法采用Western blot实验检测USP10和KLF4在人正常肝细胞系L02和HCC细胞系HepG2、HUH7、HCCLM3等中的表达差异。选取HCCLM3和HUH7细胞,将过表达或沉默USP10的慢病毒颗粒(oe-USP10或sh-USP10)转染入细胞中,并将其记为oe-USP10组和oe-NC组。免疫共沉淀(Co-IP)实验检测HCCLM3或HUH7细胞中USP10是否可与KLF4直接结合。加入蛋白酶体抑制剂MG132,再次使用Co-IP检测转染oe-USP10或sh-USP10的HCCLM3和HUH7细胞中KLF4蛋白的泛素化水平。将过表达KLF4的pcDNA3.1载体质粒及其阴性对照质粒(pc-KLF4或pc-NC)共转染入HCCLM3和HUH7的sh-USP10组或sh-NC组细胞中,并将细胞记为sh-NC+pc-NC组、sh-USP10+pc-NC组、sh-NC+pc-KLF4组和sh-USP10+pc-KLF4组,采用CCK-8法检测HCCLM3和HUH7中各组细胞的增殖活力,Transwell实验检测各组细胞的侵袭能力。结果与L02细胞比较,USP10和KLF4在HepG2、HUH7、HCCLM3等细胞中蛋白表达均降低(P<0.05)。在HCCLM3和HUH7细胞中,USP10蛋白可直接与KLF4相互结合。同时,MG132处理后,HCCLM3和HUH7细胞中KLF4蛋白表达量呈时间依赖性增加。沉默USP10可增加HCCLM3与HUH7细胞中KLF4的泛素化,过表达USP10可降低上述细胞中KLF4的泛素化水平。与sh-NC+pc-NC组比较,sh-USP10+pc-NC组中HCCLM3和HUH7的增殖和侵袭能力均升高(P<0.01),而sh-NC+pc-KLF4组和sh-USP10+pc-KLF4组的HCCLM3或HUH7细胞增殖和侵袭能力均降低(P<0.05);与sh-USP10+pc-NC组比较,sh-USP10+pc-KLF4组细胞的增殖和侵袭能力均降低(P<0.05)。结论在HCC细胞中USP10通过去泛素化促进KLF4蛋白稳定性,进而抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭。

蛋白酶体抑制剂MG132诱导人血管平滑肌细胞凋亡及其机制研究

目的:观察蛋白酶体抑制剂MG132对人脐静脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的致凋亡作用及其对凋亡相关的天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)表达的影响。方法:采用多个浓度(2.5、5、10μmol/L)的蛋白酶体抑制剂MG132处理人脐静脉VSMC 24 h和48 h;流式细胞术分析细胞凋亡率;RT-PCR检测泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)相关基因泛素、泛素活化酶(E1)、泛素缀合酶(E2)、泛素连接酶(E3)、26S蛋白酶体和caspase3基因转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase 3蛋白表达。结果:蛋白酶体抑制剂MG132处理48 h后细胞凋亡率增加;细胞内UPP相关的基因mRNA表达降低,而caspase 3 mRNA表达增高;免疫细胞化学检测细胞caspase 3蛋白表达水平升高。结论:蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导人脐静脉VSMC凋亡,其作用呈量-效关系;MG132诱导VSMC凋亡与下调UPP相关基因和上调caspase3基因及蛋白的表达有关。

泛素特异蛋白酶39基因在乳腺癌中的表达及其临床意义

目的检测泛素特异蛋白酶39（US39）基因在乳腺癌组织中的表达，探讨其表达与乳腺癌发生发展的关系。，方法选取108例配对的乳腺癌和乳腺癌癌旁组织，采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real．timePCR）检测USP39mRNA在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达，并结合临床病婵资料进行相关分析。结果USP39mRNA在乳腺癌组织中表达（△Ct=5．76±0．18）是癌旁组织（△Ct=7．19±0．19）的2．69倍，表达量显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（t=2.36，P〈0．05）。结合临床病理资料统计分析表明，USP39的高表达与患者年龄、组织学分级、TNM分期、增殖细胞核抗原（Ki．67）表达明显相关（P〈0．05）。结论USP39mRNA在乳腺腺癌组织中明显呈高表达状念，USI^9的高表达与乳腺癌患者预后不良的一些临床病理指标相关，USP39在乳腺癌的发生发展t}l发挥作用。

泛素特异蛋白酶4研究进展

泛素特异蛋白酶4(ubiquitin-specific protease 4,USP4)是一种重要的去泛素化酶,它通过识别特异性靶蛋白,使之去泛素化来阻碍其降解或改变其特性,在肿瘤、病毒感染及多种信号通路中发挥重要调节作用。但目前有关USP4在肿瘤形成和发展过程中究竟行使癌基因抑或是抑癌基因的功能尚存在争议。本文从USP4的结构、功能及信号通路等方面对其研究进展作一介绍。

核糖体蛋白S9在多发性骨髓瘤中的表达及对其细胞生物学功能的影响

目的明确核糖体蛋白S9(RPS9)在多发性骨髓瘤中的表达情况,并明确其对骨髓瘤细胞生物学特性的影响及相应机制。方法 选取10例健康志愿者骨髓单个核细胞(CON组)与30例多发性骨髓瘤患者骨髓CD138+细胞(CD138+组),实时荧光定量PCR检测RPS9在mRNA水平的表达,并选取3例CON与11例CD138+细胞,Westernblot检测RPS9在蛋白水平的变化,同时选取GSE19784数据集,检测RPS9的表达与患者总体生存率、核因子-κB(NF-κB)、类泛素蛋白修饰分子(SUMO)、泛素通路之间的关系。随后构建RPS9-短发夹RNA(shRNA)敲低载体,使用流式细胞仪检测感染效率、实时荧光定量PCR与Westernblot检测敲低效率后。RPMI8226分为CON与RPS9-shRNA组,使用膜联蛋白V别藻青蛋白/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡的变化、CCK8法检测细胞增殖的变化、PI染色法检测细胞周期的变化。并构建类泛素蛋白修饰分子特异蛋白酶1(SENP1)过表达载体,Westernblot确定过表达效率后,检测RPS9抑制后SENP1表达的变化,并在RPS9-shRNA中转染SENP1过表达载体,Westernblot检测CON、RPS9-shRNA、RPS9-shRNA-SENP1细胞中NF-κB通路P65、抑制因子κBα(IκBα)磷酸化水平的变化,膜联蛋白V/PI双染法检测细胞凋亡的变化。结果 RPS9在10例健康志愿者骨髓单个核细胞(CON)以及30例多发性骨髓瘤患者骨髓CD138+细胞中相对表达量分别为1.00±0.12和5.45±0.71(t=4.291,P=0.0036),Westernblot中大多数骨髓瘤CD138+细胞中RPS9呈现高表达,RPS9的高表达同时与患者髓外浸润相关,并在GSE19784数据集中与患者总体生存率相关。RPMI8226在感染CON与RPS9-shRNA慢病毒48h后,流式细胞仪证实两组细胞感染效率均在90%以上,实时荧光定量PCR与Westernblot证实RPS9在mRNA与蛋白水平的表达均受到抑制。RPMI8226CON与RPS9-shRNA感染病毒48h后,CON与RPS9-shRNA组细胞膜联蛋白V阳性细胞比例分别为3.47±0.37和18.60±1.64,RPS9-shRNA组显著高于CON组(t=9.015,P=0.0008)。在增殖中,CON组与RPS9-shRNA组在72h时增殖指数差异有统计学意义(t=6.846,P=0.0024)。而在细胞周期中,CON与RPS9-shRNA组在感染病毒48h时,G2期细胞比例分别为(29.28±3.42)%和(10.43±1.43)%,CON组显著高于RPS9-shRNA组,差异有统计学意义(t=9.329,P=0.0007)。RPS9的表达在GSE19784数据集中与SENP1正相关,并与IκBα编码基因NFKBIA呈负相关,Westernblot进一步证实RPS9的敲低能够抑制SENP1的表达,并抑制NF-κB亚基P65、抑制因子IKBα的磷酸化,促进IKBα的表达,而SENP1的过表达不仅能够阻碍这一效应,也能够使RPS9诱导的凋亡减少。结论 RPS9在多发性骨髓瘤CD138+细胞中高表达,且与患者总体生存率、髓外浸润相关。RPS9的抑制能够促进骨髓瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞并抑制增殖。RPS9能够通过SENP1影响NF-κB通路的活化,并影响细胞的凋亡,提示SENP1可能为RPS9生物学效应的关键因素。

阻断泛素-蛋白酶体通路对人原代白血病细胞的作用

阻断泛素-蛋白酶体通路对不同类型细胞具有完全不同的结果,但未见对原代白血病细胞作用的报道.观察了阻断上述通路对8例白血病患者和10例正常人骨髓单个核细胞（MNC）的作用.结果表明,不同个体原代白血病细胞对阻断此通路的反应敏感性存在明显差异,其中3例细胞极为敏感,24h以内90％细胞被迅速诱发凋亡,而正常人骨髓MNC对阻断泛素蛋白酶体通路反应不敏感,未观察到凋亡现象发生.进一步的免疫印迹实验发现,对上述通路敏感的原代白血病细胞Bcl-2蛋白表达量较高,而且在凋亡过程中发生了特异位点的酶解;对上述通路不敏感的细胞（包括正常人骨髓MNC）Bcl-2蛋白低表达,或Bcl-2高表达但未能检测到其特异性酶解现象.结合其他实验结果,提示细胞中Bcl-2蛋白是否发生特异位点酶解与细胞对阻断上述通路的敏感性之间具有相关性,为进一步研究不同种类细胞对阻断泛素-蛋白酶体通路敏感性差异的机制提供了线索.

MG132诱导人血管平滑肌细胞凋亡及对caspase3表达的影响

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人脐静脉血管平滑肌细胞(VSMC)的致凋亡作用及其对凋亡相关的天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)表达的影响。方法采用多个浓度(2.5,5,10μmol/L)的蛋白酶体抑制剂MG132处理人脐静脉VSMC48h;DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡率;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测caspase3基因转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase3蛋白表达。结果蛋白酶体抑制剂MG132处理48h后细胞凋亡率增加;RT-PCR检测发现细胞内凋亡相关基因caspase3mRNA表达上调;免疫细胞化学检测细胞caspase3蛋白表达水平升高。结论蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导人脐静脉VSMC凋亡,其作用呈量-效关系;MG132诱导VSMC凋亡的机制可能与MG132抑制泛素-蛋白酶体途径(UPP)活性,促进caspase3基因转录,使细胞内caspase3增加而促进细胞凋亡。

曲妥珠单抗治疗前后乳腺癌中USP39、EphA2的表达量及其与肿瘤病理特征的相关性

目的:研究曲妥珠单抗治疗前后乳腺癌中泛素特异蛋白酶39(USP39)和Eph受体酪氨酸激酶A2(EphA2)的表达量及其与肿瘤病理特征的相关性。方法:收集2013年5月~2016年9月曲妥珠单抗治疗前后的乳腺癌组织,检测乳腺癌中USP39、EphA2以及增殖抑制基因、侵袭促进基因的表达量,计算治疗后乳腺癌中USP39、EphA2表达量的四分位数。结果:治疗后乳腺癌中USP39、EphA2、Sam68、Gab2的mRNA表达量显著低于治疗前,ALEX1、PTPN14、ARID1A的mRNA表达量显著高于治疗前;不同USP39、EphA2 mRNA表达量乳腺癌中ALEX1、PTPN14、ARID1A、Sam68、Gab2的mRNA表达量差异有统计学意义(P<0.05);USP39、EphA2的mRNA表达量越高,ALEX1、PTPN14、ARID1A的表达量越低,Sam68、Gab2的mRNA表达量越高。结论:曲妥珠单抗治疗能够通过抑制USP39、EphA2的表达来影响肿瘤的恶性生物学行为及病理特征。