亚洲牛带绦虫泛素缀合酶基因及其蛋白质结构与功能的生物信息学分析

目的分析和预测亚洲牛带绦虫泛素缀合酶基因及其编码蛋白的结构与功能特性,用于指导其生物学功能的实验研究。方法利用美国国家生物技术信息中心和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,如VectorNTIsuite,从亚洲牛带绦虫成虫cDNA质粒文库中识别出泛素缀合酶基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白质的理化特性、翻译后的修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构等。结果该序列为全长基因,编码区为76bp-537bp,编码154个氨基酸。该序列为泛素缀合酶基因同源序列。其编码蛋白的理论分子量为17397.1,亚细胞定位在细胞核。预测该蛋白无跨膜区。与吸虫属的泛素缀合酶进化关系最近。结论应用生物信息方法从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了亚洲牛带绦虫泛素缀合酶cDNA全长序列并预测得到其结构与功能方面的信息。

亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2的克隆表达及免疫鉴定

目的克隆表达亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2(UBCE2)全长编码序列,获得纯化的重组蛋白,为进一步功能研究做充分准备。方法以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含有UBCE2基因的质粒作为模板,扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,测序鉴定重组质粒,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,并使用Western blotting分析其免疫反应性。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-UBCE2构建成功,该基因在大肠杆菌中以包涵体形式得到表达,十二烷基肌氨酸钠纯化后蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠杆菌BL-21/DE3得到高效表达,亲和层析得到高纯度的蛋白且该重组蛋白可被亚洲带绦虫及牛带绦虫患者血清识别,表明其有免疫反应性。结论亚洲牛带绦虫UBCE2可在原核表达系统中表达,并具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能奠定基础。

氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡时泛素缀合酶和p53的表达

为研究氧化型低密度脂蛋白致U937细胞凋亡时泛素—蛋白酶体通路中泛素缀合酶、p5 3与泡沫细胞凋亡之间的关系 ,用氧化型低密度脂蛋白处理人单核细胞U937细胞 ,诱导其凋亡 ,采用DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测细胞凋亡 ,逆转录聚合酶链反应检测泛素缀合酶和p5 3的基因表达 ;流式细胞术分析泛素缀合酶、载脂蛋白B和P5 3的蛋白表达。结果发现 ,氧化型低密度脂蛋白可以诱导U937细胞凋亡 ,在U937细胞凋亡过程中泛素缀合酶表达降低 ,p5 3表达增高 ,而且细胞内载脂蛋白B也增加。结果提示 ,泛素缀合酶的表达降低可能使P5 3和载脂蛋白B经泛素—蛋白酶体通路的降解减慢 ,从而引起P5 3和载脂蛋白B在细胞内积聚 。

水稻泛素缀合酶样蛋白基因OsCROC-1A的克隆与表达分析

为研究水稻泛素缀合酶样蛋白的序列特征、基因表达模式及亚细胞定位模式,采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),从水稻日本晴中鉴定并分离到1个泛素缀合酶样蛋白基因即OsCROC-1A的开放阅读框.序列分析结果表明,该基因编码1个具有146个氨基酸的蛋白质,含UBC保守功能域和催化位点D.比对分析结果表明,OsCROC-1A蛋白与其他CROC-1蛋白之间具有很高的相似性(42.61%～84.14%).聚类分析结果也显示出良好的物种属性.实时荧光定量PCR分析结果表明,OsCROC-1A在水稻各组织中均有表达,其中,在叶片、根、外稃中的表达量相对较高,在内稃、茎、雌蕊、愈伤组织中的表达量次之,而在雄蕊中的表达量相对最低.经4℃低温、20mmol/L H2O2、0.01%甲基磺酸甲酯等胁迫处理使胚性愈伤中的OsCROC-1A表达量显著上调,经300mmol/L甘露醇、100μmol/L脱落酸、200mmol/L NaCl胁迫处理则使愈伤组织中的OsCROC-1A表达量降低.OsCROC-1A与EGFP的融合蛋白表达于细胞质及细胞核中.这些结果为进一步研究该基因的生物学功能及其调控机制奠定了基础.

泛素缀合酶样蛋白的研究概况

在泛素缀合途径中,泛素缀合酶起关键作用,各种不同的泛素缀合酶决定了泛素缀合途径功能的多样性。泛素缀合酶样蛋白存序列和二、三级结构上类似于泛素缀合酶,但不具备泛素缀合酶的泛素缀合活性。泛素缀合酶样蛋白可能是蛋白泛素化的新的调节因子。

利用癌症基因组图谱数据库分析泛素结合酶E2S在肺腺癌中的表达及临床意义

目的研究泛素结合酶E2S(UBE2S)在肺腺癌及其癌旁组织中的表达及临床意义。方法从癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载肺腺癌患者临床信息资料,比较337例肺腺癌组织与59例癌旁组织中UBE2S表达水平,分析UBE2S与肺腺癌患者临床病理特征的相关性及对预后的影响。并通过Cox比例风险模型分析影响肺腺癌患者预后的因素。结果肿瘤组中UBE2S表达水平高于癌旁对照组(P<0.05),同一患者肺腺癌组织中UBE2S表达水平高于癌旁组织(P<0.05);UBE2S的表达水平与Stage分期、T分期、N分期有关(P<0.05);UBE2S表达水平与肺腺癌患者预后有相关性(P<0.05),高UBE2S表达水平及Stage分期是影响肺腺癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。结论UBE2S在肺腺癌组织中表达上调,高表达提示患者预后差,UBE2S可能参与肺腺癌发生发展过程,进而影响预后。UBE2S可作为肺腺癌患者的潜在治疗靶点。

水稻泛素缀合酶基因OsUbc13的分子特征和蛋白互作研究(英文)

研究目的:通过研究水稻泛素缀合酶基因OsUbc13的序列特征、表达模式、亚细胞定位模式及其互作分子,为深入研究该基因的生物学功能和分子作用机理奠定基础。创新要点:首次对植物Ubc13进行了亚细胞定位研究及蛋白互作研究。研究方法:通过序列比对及聚类分析进行OsUbc13的序列特征研究;通过实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)进行OsUbc13的表达模式分析;通过聚乙二醇(PEG)介导转化烟草BY-2原生质体进行OsUbc13亚细胞定位研究(见图4);通过酵母双杂交进行OsUbc13的蛋白质互作分析(见图5和表1)。重要结论:OsUbc13编码具有153个氨基酸的蛋白质,其推断的氨基酸序列与其它同源序列具有很高的相似性;该基因在水稻各组织中均有表达,其中内稃、雌蕊、雄蕊和叶片中的表达量较高,而根、茎和外稃中的表达量较低;低温、甲基磺酸甲酯(MMS)和过氧化氢(H2O2)胁迫处理使胚性愈伤中OsUbc13的表达量显著上调,甘露醇、脱落酸(ABA)和氯化钠(NaCl)胁迫则使愈伤组织中该基因的表达量降低;OsUbc13与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白表达于质膜和核膜处;酵母双杂交结果表明约有20个蛋白可能与OsUbc13存在相互作用,其中OsVDAC(与细胞凋亡有关)、OsMADS1(与花器官发育有关)、OsB22EL8(与活性氧清除及DNA保护有关)和OsCROC-1(为Lys63聚合泛素链形成及运行无误性DNA损伤耐受机制所必需)四个蛋白经验证确与OsUbc13互作。

阿托伐他汀对人血管内皮细胞E3RSI κB酶mRNA与UBC5酶mRNA表达的影响

目的通过研究阿托伐他汀对人血管内皮细胞泛素系统中E3RSIκB酶mRNA及UBC5酶mRNA表达的影响,探讨其抗炎机制。方法采用逆转录聚合酶链反应方法观察人ECV304细胞泛素蛋白连接酶家族中的E3RSIκB酶及泛素缀合酶中的UBC5酶的mRNA表达情况。结果阿托伐他汀能剂量依赖地抑制脂多糖诱导的人ECV304细胞E3RSIκB酶及UBC5酶的mRNA表达增加,脂多糖组E3RSIκB酶及UBC5酶的mRNA相对表达量分别为4.535±0.779、1.426±0.062;阿托伐他汀0.1μmol.L-1、1μmol.L-1、10μmol.L-1组的E3RSIκB酶及UBC5酶的mRNA相对表达量分别为2.907±0.103、1.726±0.058、0.723±0.079和1.208±0.062、1.103±0.125、0.414±0.039。结论阿托伐他汀能够减轻脂多糖诱导的ECV304细胞E3RSIκB酶及UBC5酶的mRNA表达增加,说明其能通过减少核因子κB抑制因子α的降解抑制核因子κB的活性进而达到抗炎效果。

过表达Ubc9酶对乳大鼠心肌细胞低氧损伤的保护作用

目的探讨类泛素样修饰蛋白(SUMO)修饰中的泛素缀合酶类E2I(Ubc9)对体外乳大鼠心肌细胞(NRCM)急性低氧损伤的作用及其可能的机制。方法采用分离纯化细胞法培养NRCM,对NRCM分别转染5,10,20,50和100感染指数(moi)的纯化的大鼠Ubc9基因腺病毒(Adv-Ubc9),转染48 h后在荧光显微镜下分别观察其绿色荧光蛋白(GFP)的荧光强度,并用Western印迹法检测转染效率。NRCM行氧葡萄糖剥夺(OGD)分别处理0,2,4,6,12和24 h后,Western印迹法检测Ubc9、活化的胱天蛋白酶3、自噬相关蛋白P62/SQSTM1(P62)和微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达。NRCM转染Adv-Ubc9 50 moi 48 h,使得Ubc9过表达,随后OGD处理6 h,建立心肌细胞急性低氧模型,利用原位末端转移酶标记(TUNEL)技术检测细胞凋亡,Western印迹法检测Ubc9、活化的胱天蛋白酶3、P62、LC3和类泛素化修饰蛋白1(SUMO-1)的表达水平,蛋白免疫共沉淀法检测Vps34和Beclin1的SUMO化修饰水平。NRCM转染Ubc9的小干扰RNA(Ubc9-siRNA)48 h,使Ubc9沉默,随后行OGD处理6 h,Western印迹法检测活化的胱天蛋白酶3的表达水平。NRCM给予巴伐洛霉素A1(BFA1)50 nmol·L^(-1)作用2 h,Western印迹法检测LC3表达水平。结果Adv-Ubc9在50与100 moi时转染成功且效率一致,与单纯OGD组相比,过表达Ubc9能明显降低OGD引起的心肌细胞凋亡(P<0.01)、降低活化的胱天蛋白酶3的表达(P<0.01),而沉默Ubc9使心肌细胞OGD处理后的活化的胱天蛋白酶3表达上调(P<0.05),说明过表达Ubc9能抵抗OGD引起的心肌细胞凋亡。与正常对照组相比,OGD处理后,自噬底物P62发生堆积(P<0.01),自噬蛋白LC3Ⅱ明显下调(P<0.05),自噬流出现障碍;当过表达Ubc9后能明显逆转OGD引起的自噬底物P62堆积(P<0.05),改善自噬流障碍,但对自噬蛋白LC3Ⅱ影响不明显。在此基础上给予BFA1阻断自噬体与溶酶体融合过程后,与OGD+BFA1组相比,Adv-Ubc9+OGD+BFA1组的LC3Ⅱ表达明显上调(P<0.01),提示Ubc9改善自噬流障碍的作用可能与同时促进自噬激活和自噬降解过程有关;蛋白免疫共沉淀结果显示,与正常对照组相比,OGD处理后SUMO-1蛋白表达水平基本无变化,而过表达Ubc9后,SUMO-1蛋白表达明显上调(P<0.01),OGD处理后,Vps34和Beclin1的SUMO化修饰水平下调(P<0.01),而过表达Ubc9后,Vps34和Beclin1的SUMO化修饰明显上调(P<0.01),说明过表达Ubc9可能通过提高与自噬激活和自噬降解过程均相关的Vps34和Beclin1的SUMO化修饰,从而同时促进自噬激活和自噬降解过程改善OGD后的自噬流障碍,进而抵抗OGD引起的心肌细胞凋亡。结论高表达Ubc9酶能显著抑制OGD导致的心肌细胞凋亡,该保护作用可能是增强了Vps34和Beclin1的SUMO化修饰水平,从而同时促进自噬激活(形成自噬体)和自噬降解(自噬体与溶酶体融合)过程,进而改善OGD后自噬流障碍。

WSSV感染对中国明对虾bantam及其候选靶基因的影响

Bantam能够调控细胞增殖、细胞凋亡等过程,影响生物的免疫过程。本研究利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术对感染WSSV的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)肝胰腺和鳃组织内bantam表达水平进行检测,发现感染WSSV后6、12、24和48 h,中国明对虾肝胰腺中的bantam表达水平分别是对照组的(0.16±0.03)(P<0.05)、(0.63±0.26)、(0.32±0.06)(P<0.05)和(0.41±0.13)倍;中国明对虾鳃中的bantam表达水平分别是对照组的(0.30±0.17)(P<0.05)、(1.88±0.26)(P<0.01)、(0.84±0.36)和(0.51±0.25)倍。利用mi Randa软件进一步对中国明对虾bantam靶基因进行预测分析,评分最高的靶基因是泛素缀合酶E2。中国明对虾泛素缀合酶E2包含UBCc功能域。多序列比对显示,UBCc功能域氨基酸残基序列在不同物种间保守性较高。进化树分析显示,分类学地位相近的物种的泛素缀合酶E2聚为一类。q RT-PCR检测感染WSSV的中国明对虾肝胰腺和鳃中的泛素缀合酶E2表达水平,结果显示,在感染WSSV后6、12、24和48 h,中国明对虾肝胰腺中泛素缀合酶E2的表达水平分别是对照组的(0.54±0.10)、(1.19±0.62)、(3.69±0.51)(P<0.01)和(1.94±0.07)(P<0.05)倍;中国明对虾鳃中泛素缀合酶E2的表达水平分别是对照组的(0.22±0.05)、(1.34±0.38)、(4.29±0.52)(P<0.01)和(1.28±0.79)倍。研究表明,bantam和泛素缀合酶E2的表达都受WSSV侵染的影响,可能与中国明对虾和WSSV之间的互作相关。但bantam和泛素缀合酶E2表达水平的变化是对虾抵抗WSSV侵染过程的免疫反应,还是宿主基因被病毒胁迫后的结果,需要进一步验证。

反义阻断hMMS2基因表达以抑制细胞生长

将新近发现的人泛素缀合酶样蛋白基因h MMS2的 c DNA特定反向克隆到本室改建的真核细胞表达载体 p MAMneo- amp-中 ,构建了表达h MMS2反义 RNA的重组质粒 .将此反义表达重组质粒 (p MAM- anti- h MMS2 )用改良的磷酸钙法转染人羊膜 FL细胞 ,建立 FL- h MMS2 -细胞系 .比较该细胞系及 FL细胞和转染了空载体 p MAMneo-amp-的 FL细胞 (FL- MAMneo细胞 )的生长速度 ,发现 FL- h MMS2 -细胞系在地塞米松诱导下h MMS2基因表达被反义抑制后导致细胞生长受阻 ,提示 h MMS2基因为细胞生长所必需 .

鸡球虫共同抗原UCE免疫原性分析及其对多种球虫感染的免疫保护效果评估

[目的]在前期研究中,筛选到了存在于多种鸡球虫间的共同抗原泛素缀合酶结构域蛋白(UCE),本研究进一步分析其免疫原性,评估其对多种球虫感染的免疫保护效果。[方法]提取纯化的堆型艾美耳球虫孢子化卵囊总RNA,用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增堆型艾美耳球虫UCE基因(EaUCE),插入pVAX1质粒,构建真核表达质粒pVAX-EaUCE,通过RT-PCR和Western blot检测pVAX-EaUCE在鸡体内的转录和表达情况。经流式细胞术和间接ELISA法检测pVAX-EaUCE免疫后鸡体细胞免疫和体液免疫水平变化,分析其免疫原性。分别采用柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫及三者的混合卵囊人工感染雏鸡,观察感染前、后雏鸡体质量变化和排出卵囊减少量,评估其对多种球虫感染的免疫保护效果。[结果]EaUCE基因开放阅读框为444 bp,编码148个氨基酸,BLAST分析显示,柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫UCE氨基酸序列同源性均大于95%。pVAX-EaUCE能够在鸡体内成功转录和表达。pVAX-EaUCE免疫后,鸡体的CD_4^+/CD_3^+和CD_8^+/CD_3^+细胞比例显著升高,IFN-γ、IL-2、IL-4、TNFSF15、IL-17D、TGF-β4 mRNA和IgY抗体水平显著升高,表明免疫该质粒能诱导细胞和体液产生免疫反应(P<0.05)。pVAX-EaUCE免疫后,与对照组相比,免疫组鸡体质量显著增加,卵囊产量明显下降,肠道损伤也相应减轻。[结论]鸡球虫共同抗原UCE具有良好的免疫原性,可对多种球虫感染提供部分免疫保护力,有望成为抵抗多种球虫感染的候选抗原。

RIPK3基因转染的SH-SY5Y细胞中HIF-1α基因及其信号通路相关基因表达变化

目的观察受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)基因转染的神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中低氧诱导因子1α(HIF-1α)mRNA及其信号通路相关基因表达变化。方法构建表达RIPK3基因的p CMV6-AC-GFP质粒(重组质粒),培养SH-SY5Y细胞,分为实验组及对照组,分别转染重组质粒和空载质粒。采用Western blotting法检测细胞中的RIPK3蛋白,分别于培养8、14、20、26、32、38 h后,通过MTT实验检测细胞增殖情况(OD值)。采用转录组测序技术(RNAseq)及Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件检测并筛选RIPK3-HIF1α下游信号通路中的关键基因。采用微滴式数字PCR(dd PCR)检测两组细胞中的HIF-1αmRNA。结果实验组细胞中RIPK3蛋白相对表达量(0.806±0.097 5)高于对照组(0.455±0.088 6),P<0.05。随培养时间延长,实验组细胞增殖受到抑制。实验组细胞中HIF-1αmRNA相对表达量(0.015 43±0.003 47)低于对照组(0.046 28±0.010 26),P<0.05。在HIF-1α为核心的相互作用关系网络中,筛选出关键分子泛素缀合酶样蛋白(UBC)、希佩尔-林道蛋白(VHL)、转录延伸因子B多肽1(TCEB1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)。结论 RIPK3基因转染SH-SY5Y后,细胞中HIF-1αmRNA表达下调,同时HIF-1α信号通路相关基因(UBC、VHL、TCEB1、VEGFA)的表达水平受到影响。

泛素结合酶2S在恶性黑素瘤中的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响

目的探讨恶性黑素瘤(MM)组织中泛素结合酶2S(UBE2S)的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响。方法应用免疫组化检测UBE2S在128例原发性MM、64例转移性MM、16份非瘤组织(8份瘤旁组织、8份正常表皮组织)芯片中的表达。实时定量PCR检测A375、MUM-2B及MUM-2C黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。将黑素瘤A375及MUM-2B细胞株分别分为两组,干扰组使用含有UBE2S RNA干扰序列的慢病毒转染,对照组使用含有对照序列的慢病毒转染,72 h后实时定量PCR检测A375和MUM-2B黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。用试剂盒检测各组细胞caspase3/7活性,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率及周期分布;应用Transwell法及Western印迹分别检测敲减UBE2S对A375细胞迁移侵袭能力及N-钙黏蛋白表达的影响。使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,正态分布数据组间比较采用独立样本t检验,计数资料采用卡方检验,非正态分布数据比较采用Mann-Whitney U检验,通过Spearman系数评估UBE2S表达水平与T分期的相关性。结果UBE2S在98例(51.0%)MM组织中高表达,16例非瘤组织中均低表达,两组间高表达率差异有统计学意义(χ^2 = 11.905,P<0.01);UBE2S表达水平与肿瘤T分期呈负相关(ρ=-0.210,P = 0.043)。A375、MUM-2B、MUM-2C细胞间UBE2S mRNA相对表达量差异有统计学意义(F = 817.228,P<0.01)。Caspase3/7活性在干扰组A375细胞(t = 17.572,P<0.01)与干扰组MUM-2B细胞(t = 24.552,P<0.01)分别较相应对照组明显增加;干扰组A375细胞较对照组G1期细胞比例明显升高(t = 7.365,P<0.01),而S期比例明显降低(t =-9.190,P<0.01),G2/M期无明显变化(t =-0.227,P>0.05);干扰组MUM-2B细胞G1期(t = 12.676,P<0.01)、G2/M期(t = 13.045,P<0.01)细胞比例高于对照组,但S期比例低于对照组(t =-15.718,P<0.01)。Transwell实验显示,干扰组较对照组A375细胞迁移(t =-35.727,P<0.05)及侵袭(t =-125.000,P<0.01)能力降低。Western印迹检测显示,干扰组较对照组A375细胞N-钙黏蛋白表达下调。结论UBE2S在黑素瘤组织过表达,其表达水平与肿瘤分期相关;敲减UBE2S对黑素瘤细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移及侵袭能力均有影响,并且可能通过调控N-钙黏蛋白表达促进MM细胞转移。

基于Oncomine数据库及生物信息学方法挖掘UBE2C基因在卵巢癌中的表达及作用机制

目的通过深度挖掘Oncomine数据库中的基因信息,分析泛素结合酶E2C(UBE2C)在卵巢癌中的表达及作用机制。方法收集Oncomine数据库中关于UBE2C研究的信息,对其在卵巢癌的表达水平变化进行分析。采用Kaplan-Meier法分析UBE2C表达水平与卵巢癌患者生存之间的关系,探讨其临床意义。应用Genecards数据库收集与UBE2C基因相关的蛋白,并通过STRING绘制UBE2C相关蛋白网络图,分析蛋白富集的生理过程。结果在Oncomine数据库中共收集14项关于卵巢癌和卵巢正常组织UBE2C基因有差异表达的研究,对其数据进行分析,发现卵巢癌组织中UBE2C基因的表达显著高于卵巢正常组织(P<0 .05)。通过Kaplan-Meier生存分析发现高表达UBE2C基因的卵巢癌患者无病生存期、总生存期明显短于低表达者,低表达患者的预后更好(P<0 .05)。通过Genecards数据库收集到与UBE2C相关的蛋白有RLIM、CBX4、 SIAH2等25个,其相关蛋白富集分析结果显示主要富集在泛素依赖蛋白的分解代谢过程、蛋白质分解代谢过程、蛋白质泛素化、有丝分裂细胞周期中泛素-蛋白连接酶活性的调控、有丝分裂细胞周期的调节、细胞周期等生理过程。结论 UBE2C基因可能通过调节蛋白泛素化过程在卵巢癌发生、发展中发挥作用,高表达时提示卵巢癌患者预后不良,靶向UBE2C可能是一个潜在的肿瘤诊断和治疗工具。

泛素/ISG15结合酶E2L6在胰腺癌中的作用及其临床价值分析

背景与目的:胰腺癌具有高度迁移性和侵袭性的特点,预后不良,但癌基因的突变及分子调控关系等的改变会影响胰腺癌的恶性生物学行为。泛素/ISG15结合酶E2L6(UBE2L6)在泛癌中的表达及胰腺癌中的生物学功能依然不清楚。本研究拟通过生物信息学分析及实验验证,探讨UBE2L6对胰腺癌增殖、迁移侵袭能力的影响及可能的分子机制。方法:从UCSC Xena下载TCGA和GTEx的RNA-seq数据,用R(4.0.2)软件的“limma”包分析UBE2L6在泛癌中的差异表达。利用从GEO数据集下载数据及qRT-PCR分别验证UBE2L6在胰腺癌组织及细胞中的差异表达。胰腺癌细胞转染靶向UBE2L6的siRNA后用CCK-8细胞增殖、克隆形成、Transwell迁移和侵袭实验分析UBE2L6对胰腺癌细胞生物学功能的影响。利用UBE2L6的分子相关性、蛋白相互作用及基因富集分析(GSEA)探讨其可能的作用机制。进一步利用TCGA数据库的胰腺癌临床数据,分析UBE2L6的表达与其临床病理特征的关系及临床应用价值。结果:表达差异分析提示UBE2L6在泛癌中表达增高,在胰腺癌组织及BxPC-3(t=33.82,P<0.0001)、PANC-1(t=7.36,P=0.0018)、AsPC-1(t=9.61,P=0.0007)、SW1990(t=10.26,P=0.0005)及MIA PaCa-2(t=12.65,P=0.0002)等胰腺癌细胞系中亦高表达。细胞功能实验显示,UBE2L6可促进胰腺癌PANC-1和AsPC-1细胞的增殖、迁移及侵袭。Spearman相关性分析提示BCL2A1蛋白与UBE2L6的相关性最大(r=0.442)。蛋白相互作用分析显示,其可能与HERC6、RPS27A、HERC5、UBA52、ISG15、UBA7、DDX58、UBC、UBB、ARIH1等蛋白有相互作用。同时,GSEA富集分析提示UBE2L6与肿瘤免疫微环境等密切相关。而临床病理相关性分析显示,UBE2L6高表达与胰腺癌组织病理学分级密切相关(χ^(2)=6.966,P=0.031)。单因素及多因素Cox回归分析表明,年龄及淋巴结转移是胰腺癌患者的独立危险因素(P<0.05),UBE2L6的表达水平与胰腺癌患者的预后明显相关(P<0.05),但不是其独立预后因素(P>0.05)。ROC曲线及Kaplan-Meier生存分析提示,UBE2L6对胰腺癌具有较高的临床诊断价值(AUC=0.970,95%CI=0.950~0.989)且与胰腺癌患者的预后相关(P<0.05)。结论:UBE2L6在胰腺癌中表达增高并促进胰腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭,其分子机制可能与细胞凋亡、泛素化修饰、MAPK信号通路及肿瘤免疫微环境等有关,且UBE2L6表达水平与胰腺癌的诊断及预后密切相关。

泛素结合酶2S参与调控黑素瘤行为机制的生物信息学分析

目的揭示黑素瘤中可能与泛素结合酶2S(UBE2S)存在相互作用的基因,探讨UBE2S参与调控黑素瘤细胞生物学行为的分子机制。方法将A375黑素瘤细胞分为基因敲降组和阴性对照组,分别用含LV-UBE2S-RNAi(14011-1)的慢病毒和CON053慢病毒转染细胞构建UBE2S敲降细胞株和阴性对照细胞株。提取两组细胞株RNA,并将其纯化及片段化,与芯片探针杂交洗染获取芯片数据。采用Ingenuity路径分析软件对获得的差异表达基因的芯片数据进行进一步解析,鉴定可能与UBE2S存在相互作用的基因,应用免疫印迹法对UBE2S调控的下游分子进行验证。采用双尾t检验筛选差异基因。结果在基因敲降组与阴性对照组之间共筛选出差异倍数绝对值>2且P<0.05的差异基因512个,其中上调基因247个,下调基因265个。差异基因信息的Ingenuity路径分析结果证实,干扰素信号和肝X受体/视网膜X受体活化通路显著激活,真核起始因子2和核因子κB信号通路则被抑制。预测上游调控因子中IFNA2为强烈激活,核因子κB(复合物)被抑制。综合以上生物信息学分析结果,推测黑素瘤细胞UBE2S基因可通过调节IFITM1、STAT1、ISG15和TNFRSF11B基因的表达发挥功能。免疫印迹显示,A375细胞UBE2S基因敲降前后,IFITM1蛋白均未表达,敲降后ISG15蛋白表达上调19.94倍,STAT1蛋白表达上调1.47倍,TNFRSF11B蛋白表达下调79.1%。结论UBE2S可能通过与STAT1、ISG15和TNFRSF11B的相互作用,共同调控黑素瘤肿瘤细胞生物学行为。