抑制端粒酶催化亚基的表达促进Survivin蛋白的降解

背景与目的:研究表明,在肿瘤细胞中端粒酶催化亚基(hum antelom erase reverse transcriptase,hTERT)与存活素(Survivin)的表达具有相关性,本研究拟探索肿瘤细胞中hTERT与Survivin在功能上是否存在相互调控作用。方法:采用反义核酸分别抑制survivin与hTERT在H eLa S3细胞中的表达,端粒重复扩增法检测细胞中端粒酶活性的变化,并分别采用W estern印迹与RT-PCR分析细胞中Survivin蛋白水平与m RNA水平的变化,M TT法检测H eLa S3细胞的增殖变化。结果:采用反义核酸抑制H eLa S3细胞中survivin的表达对端粒酶的活性没有影响,但是采用反义核酸No.14抑制hTERT的表达可以显著降低细胞中Survivin蛋白水平,而m RNA水平未受影响。而且当反义核酸No.14的浓度在200～1000nm ol/L范围内时,Survivin蛋白水平的下降与反义寡核苷酸的浓度呈正相关,这种下降可以被泛素化蛋白酶抑制剂lactacystin和M G132所抑制。此外,在H eLa S3细胞中同时抑制hTERT与survivin的表达可以协同性地抑制细胞增殖。结论:抑制H eLa S3细胞中hTERT的表达可以促使Survivin蛋白通过泛素蛋白酶体途径降解。

E3泛素连接酶Smurf家族在骨形态发生蛋白和转化生长因子信号转导中的作用

泛素-蛋白酶体降解系统广泛存在于各种真核细胞中,参与调控细胞多种生理进程.作为该系统中行使调控降解功能的核心成员,E3泛素连接酶的重要作用已经越来越引起人们的重视.BMP和TGF-β是骨组织中调控成骨细胞和软骨细胞增殖、分化和凋亡的关键分子,通过不同的信号通路体系调控骨生理代谢,参与骨组织的多种生理进程.最近的研究表明,泛素-蛋白酶体降解系统在骨细胞和骨组织中具有十分重要的作用,E3泛素连接酶Smurf作为这一系统的核心,参与调控骨组织中BMP和TGF-β两个家族的分子信号转导过程.在前期成果的基础上,结合最新的研究进展,系统阐述了骨组织中E3泛素连接酶的发现,及其调控BMP和TGF-β信号通路的机制以及其对成骨细胞和软骨细胞增殖和分化的影响.

丙型肝炎病毒感染促进53BP1蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解的研究

目的探讨丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)对53BP1表达的影响及机制。方法建立HCV体外感染Huh7细胞模型,采用Western blot检测HCV感染对53BP1总蛋白、胞浆和胞核蛋白表达的影响,qPCR检测53BP1的mRNA表达,采用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)方法检测HCV感染对53BP1亚细胞定位的影响;采用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)法定量检测HCV相关肝癌中53BP1蛋白的表达,并与癌旁组织及正常肝脏相比较;采用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)方法检测HCV对53BP1蛋白泛素化水平的影响。结果HCV感染导致Huh7细胞53BP1蛋白的相对表达水平为(0.41±0.03),明显低于对照组(1.00±0.08),差异有统计学意义(P<0.01);在HCV感染后,胞核53BP1蛋白相对表达水平为(0.35±0.03),明显低于对照组(1.00±0.09),差异有统计学意义(P<0.01);而胞浆53BP1相对表达水平为(1.20±0.18),对照组相对表达水平为(1.00±0.17),两者表达无显著改变(P>0.05);HCV感染可导致53BP1蛋白,尤其是胞核53BP1蛋白的表达下降。免疫荧光结果显示HCV感染导致53BP1从胞核到胞浆的亚细胞定位改变;免疫组化结果显示,与正常肝脏相比,53BP1在HCV相关HCC的癌组织(P<0.01)和癌旁组织(P<0.05)中显著降低。机制分析表明HCV感染促进53BP1的泛素-蛋白酶体途径降解。结论HCV感染可致Huh7细胞53BP1发生由细胞核到细胞质的定位改变,并促进其通过泛素-蛋白酶体途径降解。

烧伤早期大鼠骨骼肌组织泛素转录表达的变化研究

目的 :研究烧伤后大鼠骨骼肌组织泛素蛋白酶体 (ubiquitin proteasome)蛋白降解途径组成成分中泛素表达的变化 ,探讨烧伤后骨骼肌蛋白降解的增强与泛素蛋白酶体蛋白降解途径表达变化间的关系。方法 :借助烫伤大鼠动物模型 ,利用骨骼肌离体孵育系统 ,应用氨基酸自动分析仪测定孵育液和骨骼肌组织中酪氨酸(Tyr)和 3甲基组氨酸 (3MH)量的变化 ,用 RNA印迹技术 (Northern blot)方法测定骨骼肌组织中泛素m RNA表达水平。结果 :烧伤后大鼠骨骼肌释放 Tyr和 3MH增多 ,以 3MH增加显著 ;烧伤后骨骼肌组织中泛素 2 .4kb的 m RNA表达上调明显。泛素 m RNA表达增加量与 Tyr和 3MH增加量间均呈显著正相关。结论 :烧伤后大鼠骨骼肌蛋白降解明显增强 。

心肌素在周期性张应变调控血管平滑肌细胞表型转化中的作用

目的探讨周期性张应变条件下诱导血管平滑肌细胞(VSMC)表型转换时,心肌素在其中可能的作用。方法应用FX-5000T体外周期性张应变加载系统,分别对体外培养的VSMC施加频率为1.25 Hz、加载幅度为5%(正常张应变状态)、15%(高张应变状态)的周期性张应变力学刺激,加载时间为24 h。采用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR技术检测心肌素、肌肉萎缩相关基因1(atrogin-1)及相关收缩蛋白SMA、SM22的蛋白表达水平和mRNA水平;敲除atrogin-1后测心肌素及相关收缩蛋白SMA、SM22的变化;用蛋白酶体抑制剂MG132处理后测心肌素和atrogin-1的表达水平。结果与5%正常张应变组比较,15%高张应变促进平滑肌细胞的去分化。15%高张应变下调心肌素和SMA、SM22蛋白水平;上调atrogin-1蛋白表达水平;下调心肌素和SMA、SM22的mRNA水平,上调atrogin-1 mRNA水平。应用siRNA特异性下调atrogin-1后,心肌素、SMA、SM22蛋白水平均上升。用1μmol/L MG132处理细胞后,心肌素、SMA、SM22的蛋白水平上升,atrogin-1蛋白水平下降。结论周期性高张应变可以通过调节血管平滑肌细胞中atrogin-1/心肌素轴来调控血管平滑肌表型转换,进而影响VSMC的分化增殖。

HIV-1 Vif与机体内在抗病毒因子APOBEC3G的研究进展

近期研究表明,非允许性细胞中存在的载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)是机体内在的抗病毒因子,它在人免疫缺陷病毒(HIV)反转录过程中,使所形成的负链cDNA中的胞嘧啶脱氨,进而降低病毒的感染力。而Vif蛋白可结合APOBEC3G,并激活泛素-蛋白酶体途径,使之降解,拮抗APOBEC3G的抗病毒活性,且二者之间的相互作用还存在种属特异性。Vif与APOBEC3G间的相互作用,为抗HIV药物的研究提供了新靶点。