眼镜王蛇泛素融合蛋白基因和核糖体蛋白L30基因的克隆及分析

从广西产眼镜王蛇(Ophiophagushannah)毒腺中抽提总RNA,经mRNA纯化后构建眼镜王蛇毒腺cDNA文库。从所构建的cDNA文库中,随机筛选200个克隆测序,得到两个在进化上高度保守的基因:泛素融合蛋白基因(GenBank登录号为AF297036)和核糖体蛋白L30基因(GenBank登录号是AF297033)。前者cDNA的开放阅读框为387bp,后者为348bp。前者编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;后者编码115个氨基酸残基组成的核糖体蛋白L30前体。由cDNA序列推导出的氨基酸序列分析表明,泛素融合蛋白前体包括N-末端的泛素结构域(76个氨基酸残基)和C-末端的核糖体蛋白L40结构域(52个氨基酸残基)。该蛋白为一高碱性蛋白,C末端含有一个“锌指”模式结构。与16个物种比较的结果表明,眼镜王蛇与脊椎动物的泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性。

斑节对虾泛素融合蛋白UbS27基因克隆与表达分析

从构建的斑节对虾（Penaeus monodon）肝胰腺转录组数据中筛选出泛素核糖体融合蛋白Ub S27基因（ubiquitin/ribosomal S27 fusion protein,Pm Ub S27）片段,利用SMART-RACE技术克隆出Pm Ub S27基因c DNA全长,并利用软件对其结构进行分析;利用实时荧光定量技术检测Pm Ub S27基因在斑节对虾不同组织及卵巢不同发育期的表达情况。结果显示,Pm Ub S27基因c DNA全长为514 bp,开放阅读框465 bp,编码154个氨基酸,含有泛素（1~72 aa）和核糖体蛋白（101~147 aa）2个结构域。以DNA为模板克隆得到的基因序列由3个内含子和4个外显子组成。实时荧光定量结果显示,Pm Ub S27基因在斑节对虾各组织中均有表达,但是在卵巢中表达量最高,其次为肝胰腺、血淋巴和精巢。Pm Ub S27在卵巢发育前期（Ⅱ期）和成熟期（Ⅴ期）的表达量显著高于其他各期（P〈0.05）。结果表明,Pm Ub S27参与斑节对虾卵巢发育的过程并可能在卵巢发育进程中起到重要的调控作用。

斑节对虾泛素融合蛋白UbL40基因的克隆及表达分析

从斑节对虾（Penaeus monodon）肝胰腺转录组数据中筛选获得泛素融合蛋白Ub L40基因（ubiquitin/ribosomal L40 fusion protein,Pm Ub L40）的部分序列,利用RACE技术克隆其c DNA全长序列,通过生物信息学进行结构分析;利用实时定量PCR技术检测该基因在斑节对虾不同组织及卵巢不同发育期的表达情况。结果表明,Pm Ub L40基因c DNA全长571 bp,开放阅读框（Open reading frame,ORF）长390 bp,编码129个氨基酸,预测分子量约14.7 ku,理论等电点为9.76。预测氨基酸序列的N-末端（1～76aa）为高度保守的泛素结构域,C-末端（77～129aa）为典型的核糖体蛋白L40结构域。多重序列比对表明不同物种的Ub L40在进化过程中高度保守。实时定量PCR结果显示Pm Ub L40基因在肝胰腺的表达量最高,肌肉、卵巢次之,其他组织的表达较低;在卵巢发育过程中Pm Ub L40基因在II期表达最高,其次是V期,显著高于I、III、IV期。研究结果表明Pm Ub L40基因在斑节对虾卵巢发育过程中可能具有重要作用。

栗疫病菌泛素核糖体L40融合蛋白基因的克隆与分析

用酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisae)泛素融合蛋白基因从COGEME(Consortium for the functional ge-nomics of microbial eukaryotes)植物病原菌EST(Expressed sequence tag)库中BLAST(Basic local alignment searchtool)得到栗疫病菌的泛素融合蛋白EST,设计引物从栗疫病菌cDNA中克隆到该基因并测序,得到在进化上高度保守的基因,该基因开放阅读框为387 bp,编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;由cDNA序列推定的氨基酸序列分析结果表明,泛素融合蛋白前体包括氮末端的泛素结构域(76个氨基酸残基)和碳末端的核糖体蛋白L40结构域(52个氨基酸残基)。该蛋白为高碱性蛋白,碳末端含有一个"锌指"模式结构。与19个物种比较的结果表明,栗疫病菌与真菌泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性。

早期糖尿病肾病泛素-核糖体融合蛋白52和尿微量清蛋白关系研究

目的探讨泛素-核糖体融合蛋白52(UBA52)在早期糖尿病肾病(DN)患者中的表达及其与尿微量清蛋白(MAU)的关系。方法选取2012年2月—2013年3月新疆医科大学第五附属医院收治的糖尿病患者20例(糖尿病组),DN患者59例(DN组)。另选取同期在本院体检健康者22例作为对照组。采用免疫透射比浊法检测3组受试者MAU,采用ELISA法检测血UBA52、尿UBA52。结果 3组性别、年龄、BMI比较,差异均无统计学意义(P>0.05);3组血糖、糖化血红蛋白、总胆固醇比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。3组血UBA52、尿UBA52、尿蛋白定量和MAU比较,差异均有统计学意义(P<0.05),其中DN组血UBA52、尿UBA52、尿蛋白定量和MAU均高于对照组和糖尿病组,糖尿病组尿蛋白定量、MAU均高于对照组(P<0.05)。多元线性回归分析结果显示,MAU和糖化血红蛋白影响DN患者尿UBA52水平(P<0.05)。结论 DN患者血UBA52、尿UBA52水平升高,MAU是尿UBA52水平的影响因素。

小麦泛素融合降解蛋白基因全长cDNA的克隆及分析

实验利用RT PCR技术,在小麦矮苏3品种中克隆了1个编码泛素融合降解蛋白基因的cDNA,并且含有完整的5′端,将该基因命名为Tufd1,利用RACE技术克隆了该cDNA的3′端。根据这2段cDNA克隆,设计特异引物,利用RT PCR扩增出了Tufd1完整的开放读码框(ORF),其编码区长948bp,编码315个氨基酸的多肽,在NCBI中运行BLAST。分析表明,Tufd1蛋白同拟南芥的UFD1蛋白有74%的同源性,在所编码的多肽链的N 端有UFD1保守结构域,可作为催化蛋白降解的信号。

缺血性中风病急性期泛素融合降解蛋白的临床意义

在脑缺血发生的急性期,缺血、缺氧的程度越严重,神经元细胞死亡越多,细胞内重要非溶酶体蛋白水解途径泛素-蛋白酶体系统(UPS)功能受损越严重,泛素融合降解蛋白(UFD1)是UPS的重要组成部分,其作为与神经细胞凋亡相关的生物学指标则表现的相关性就越强,UFD1可能与缺血性中风病急性期神经功能缺损程度及证候程度、证候变化密切相关。在缺血性中风病急性期动态监测血清UFD1变化时同步利用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)、缺血性中风证候评价量表进行中风病疾病、证候疗效动态评价,探讨生物学指标UFD1血清水平与NIHSS评分、证候评分的相关性,即可明确UFD1在中风病急性期中"病证"疗效评价中的价值。

酵母双杂交筛选与蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白--泛素-52氨基酸融合蛋白的鉴定

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶.为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验.以初步筛选与人蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白的阳性候选克隆,筛选获得8个阳性克隆,其中1个与人泛素-52氨基酸融合蛋白基因(UBA52)的cDNA序列有高度同源性(100%).GST pull-down实验在细胞外进一步证实了CK2α′与UBA52之间存在相互作用.本实验证明,人泛素-52氨基酸(UBA52)融合蛋白是人CK2α′亚基的相互作用蛋白,它们之间的相互作用对精子发生机制的影响尚不清楚,进一步分子机制研究正在进行中.

泛素融合降解蛋白基因UFD1对植物抗病和抗逆性的调控功能分析

采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)克隆获得1个番茄泛素融合降解蛋白(ubiquitin fusion degradation protein,UFD)基因片段UFD1,并应用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术分析该基因对植物抗病性和抗逆性的调控功能.结果表明:在本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株中UFD1基因的沉默导致Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介导的过敏性反应(hypersensitive response,HR)以及水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)诱导的HR显著减弱,烟草野火病坏死症状明显减轻,在高盐胁迫下叶片叶绿素含量显著降低,但对菌核病病害症状以及抗干旱能力的影响不明显.表明UFD1基因是植物抗病和抗逆性的重要调控因子,它可能对Cf-4/Cf-9介导的基因对基因抗性、对Xoo的非寄主抗性和耐盐性起正向调控作用,而对烟草野火病抗性起负调控作用.

小麦泛素融合降解蛋白基因的克隆及特征分析

酵母UFDI基因编码的泛素融合降解蛋白是泛素依赖性降解系统或泛素融合降解途径中的一个关键因子。利用RT-PCR技术在小麦(Triticum aestivum L．)中分离到一个UFD1类似基因。该基因的编码区长948bp，编码长315个氨基酸的多肽，其氨基酸序列与GenBank中登录的一个拟南芥UFD1类似蛋白有74％的同源性。在多肽链的N-端具有在真核生物中高度保守的UFD1结构域。我们将该基因定位在小麦的第六染色体群并将其命名为TUFD1。Southern杂交和数据库搜索表明植物的UFD1基因是单拷贝或低拷贝的。无论是在单子叶中还是在双子叶植物中，UFD1蛋白都高度同源。除了N端UFD1结构域外，该类蛋白还有3个高度保守的C端结构域。TUFD1基因在小麦幼苗的根、茎、胚芽鞘、叶片以及幼穗和腊熟期子粒中呈组成性表达。

泛素-核糖体融合蛋白52——糖尿病肾病的早期生物标志物

目前,泛素-核糖体融合蛋白52(UbA52)是对早期糖尿病肾病(DN)有重要诊断价值的生物标志物。UbA52由一种泛素编码基因UbA52翻译表达,其可能通过参与氧化应激及泛素-蛋白酶体途径(UPP),从而参与早期DN的发病。UbA52水平与体内血糖水平呈正相关,并仅表达于肾小管;而尿中UbA52的水平直接与DN的关系密切。目前已被认为是DN早期诊断的标志物,并且基于尿蛋白组学技术的这一领域正在飞速发展。

糖尿病视网膜病变患者检测尿泛素-核糖体融合蛋白52的临床意义

目的探讨糖尿病视网膜病变患者检测尿泛素-核糖体融合蛋白52的临床意义。方法收集该院内分泌科、肾内科、眼科2016年1月—2019年12月住院的2型糖尿病患者共264例,将其分为非DR组(无视网膜病变的糖尿病患者)50例,NPDR(背景型糖尿病视网膜病变)组156例、PDR(增殖型糖尿病视网膜病变)组58例,NPDR组根据病变分期情况细分为3个亚组:NPDR1组(Ⅰ期)52例、NPDR2组(Ⅱ期)52例、NPDR3组(Ⅲ期)52例;并选取对照组(健康体检者)100名。通过检测各组患者的尿UbA52、尿白蛋白与肌酐比值(ACR)、尿微量白蛋白(Alb)、血CysC、血肌酐(Scr)等指标,比较不同组别各肾损害指标的差异情况,再将264例糖尿病患者的尿UbA52根据4分位距分为4个等级,采用Spearman秩相关分析方法探讨尿UbA52与糖尿病视网膜病变程度之间的相关关系。结果尿ACR、尿Alb、血CysC及血Scr均只在NPDR3组和PDR组与对照组相比组间均数差异有统计学意义(P<0.05)。而尿UbA52在NPDR1组、NPDR2组、NPDR3组及PDR组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),同时各组间的均数采用LSD多重比较后差异有统计学意义(P<0.05),从均值上看,随着糖尿病视网膜病变程度的加重,各组尿UbA52的均数逐渐升高。糖尿病患者的尿UbA52与视网膜病变程度的Spearman秩相关分析结果显示Spearman秩相关系数为0.681,呈显著正相关(P<0.001)。结论糖尿病患者尿UbA52随视网膜病变程度的加重而逐渐升高,提示其与糖尿病视网膜病变呈现较好的平行关系,尿UbA52与DR的发生具有显著的相关性,故而尿UbA52是可作为预测DR、DN发生发展的一个临床生物指标。尿标本易于取得,尿UbA52检测方法成熟,易于临床推广。

血清泛素-核糖体融合蛋白52联合α-klotho蛋白对早期糖尿病肾病的诊断价值

目的探讨血清泛素一核糖体融合蛋白52（UbA52）联合α-klotho蛋白测定对早期糖尿病肾病（DN）诊断的意义。方法选取2015年10月～2016年9月于我院住院的2型糖尿病（T2DM）患者77例，根据估算的肾小球滤过率（eGFR）并结合肾脏损害程度的Mogensen分级标准，将其分为单纯2型糖尿病组（T2DM组）35例和2型糖尿病早期肾病组（DN组）42例，另选取同期我院门诊体检的健康人群30例为对照组（NC组），检测各组的血清UbA52、d—klotho蛋白、24h尿微量白蛋白（mAlb）水平，计算eGFR并进行比较分析。结果T2DN组患者血清UbA52和24h尿mAlb水平明显高于NC组和T2DM组，且α-klotho蛋白和eGFR水平明显低于NC组和T2DM组（P〈0．05）。T2DN组患者血清UbA52与24h尿mAlb呈正相关（r=0．478，P〈0．05），与eGFR呈负相关（r=-0．529，P〈0．05）；α-klotho蛋白与24h尿mAlb呈负相关（r=-0．593，P〈0．05），与eGFR呈正相关（r=0．511，P〈0．05）。结论血清UbA52和α-klotho蛋白可能作为DN早期诊断的新标记物，对早期DN的发现和治疗有重要意义。

泛素-核糖体融合蛋白52基因沉默对高糖环境下大鼠肾小管上皮细胞转化生长因子β1/Smad信号通路的影响

目的 探讨RNA干扰（RNAi）介导泛素-核糖体融合蛋白52（UBA52）基因沉默对高糖环境下鼠肾小管上皮细胞NRK-52E转分化信号通路转化生长因子β1（TGF-β1）/Smad的影响.方法 首先根据培养基葡萄糖浓度将NRK-52E细胞分为4组：正常对照组（5.6 mmol/L葡萄糖）、高渗对照组（5.6 mmol/L葡萄糖＋24.4 mmol/L甘露醇）、葡萄糖中浓度组（20 mmol/L葡萄糖）、葡萄糖高浓度组（30 mmol/L葡萄糖）并分别干预48 h,通过实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测并比较各组UBA52、Smad7、TGF-β1水平,观察葡萄糖浓度对上述指标的表达影响.然后采用三个不同基因序列的UBA52小干扰RNA（UBA52 siRNA）分别转染NRK-52E细胞,通过荧光定量PCR筛选出最佳转染效果的UBA52 siRNA基因序列,并确定最佳转染时间及转染剂量.然后将NRK-52E细胞分为3组：空白对照组（30 mmol/L葡萄糖）、阴性对照组（30 mmol/L葡萄糖＋无关RNA转染组）及转染组（30 mmol/L葡萄糖＋UBA52 siRNA转染）.48 h后实时荧光定量PCR法分别检测各组UBA52、TGF-β1、Smad7的mRNA表达变化,Western blotting法检测TGF-β1、Smad2/3、Smad7的蛋白表达.通过随机区组方差分析对上述指标进行统计学分析.结果 葡萄糖干预实验中正常对照组、高渗对照组、葡萄糖中浓度组、葡萄糖高浓度组肾小管上皮细胞UBA52、TGF-β1、Smad7 mRNA的表达量差异均有统计学意义（F=60.914、65.112、29.390,均P〈0.05）;葡萄糖中浓度组及高浓度组的UBA52、TGF-β1表达均明显高于正常对照组及高渗对照组,而Smad7的表达则明显低于正常对照组及高渗对照组.转染实验中空白对照组、阴性对照组及转染组TGF-β1 mRNA表达量分别为1.00±0.04、0.98±0.04、0.49±0.14,差异有统计学意义（F=26.364,P〈0.001）,转染组明显低于其他2组;3组Smad7 mRNA表达量分别为1.00±0.12、1.05±0.17、2.24±0.31,差异有统计学意义（F=22.816,P〈0.001）,转染组明显高于其他2组.3组TGF-β1蛋白表达量分别为0.676±0.357、0.613±0.011、0.184±0.073,差异有统计学意义（F=96.433,P〈0.01）,转染组表达量最低;Smad2/3的蛋白表达量分别为0.68±0.10、0.63±0.05、0.27±0.15,差异有统计学意义（F=12.194,P〈0.05）,转染组明显低于其他2组;Smad7的蛋白表达量分别为0.52±0.05、0.55±0.12、0.83±0.06,3组差异有统计学意义（F=12.154,P〈0.05）,转染组表达量最高.结论 干预高糖环境下鼠肾小管上皮细胞转分化信号通路TGF-β/Smad可能成为糖尿病肾病肾间质纤维化新的干预靶点.

苦碟子注射液静滴辅助替米沙坦口服治疗早期糖尿病肾病效果观察

目的观察苦碟子注射液静滴辅助替米沙坦口服治疗早期糖尿病肾病的疗效。方法将148例早期糖尿病肾病患者随机分为观察组和对照组各74例。两组均接受糖尿病的常规治疗并口服替米沙坦;观察组加用苦碟子注射液30 m L,加入250 m L生理盐水静滴,1次/d。观察两组临床疗效,检测两组患者治疗前后血肌酐、24 h尿微量白蛋白泛素-核糖体融合蛋白52(Ub A52)、a-Klotho蛋白。结果观察组显效59例、有效14例、无效1例,总有效率98.6%。对照组分别为40、25、9例,总有效率87.8%。观察组总有效率高于对照组(P<0.05)。两组患者治疗后血清肌酐和24 h尿微量白蛋白均较治疗前下降(P均<0.05)。观察组患者治疗后血清肌酐和24h尿微量白蛋白均低于对照组治疗后(P均<0.05)。与治疗前相比,两组患者治疗后血清Ub A52水平下降,a-Klotho蛋白水平升高(P均<0.05)。与对照组治疗后相比,观察组患者治疗后血清Ub A52水平更低,a-Klotho蛋白水平更高(P<0.05)。结论苦碟子注射液静滴辅助替米沙坦治疗早期糖尿病肾病效果好于单用替米沙坦。

UBA52在早期糖尿病肾病中的诊断价值

目的:探讨泛素核糖体融合蛋白52(UbA52)在糖尿病肾病早期中的诊断价值。方法:将收集到的59例早期糖尿病肾病患者作为DN组、20例单纯糖尿病患者作为DM组、22例健康人群作为对照组,分别测定3组研究对象的白蛋白/肌酐比值(ACR)、血UbA52、尿UbA52、N-乙酰-β-D氨基葡萄糖甘酶(NAG)、α1微球蛋白、24h尿蛋白定量值,并分析相互之间的相关性。结果:3组研究对象的ACR、血UBA52、尿UBA52、NAG酶、α1微球蛋白、尿蛋白定量测定值差异均具有统计学意义(P<0.05)。对ACR值校正后进行偏相关分析,得出血UBA52与尿UBA52值呈显著的正相关关系(r=0.403,P<0.001)。结论:糖尿病肾病患者的血、尿UBA52测定值与ACR、24h尿蛋白定量具有显著的相关性,通过检测UBA52值对糖尿病肾病患者的疾病情况进行判断。

早期糖尿病肾病患者UBA52与ACR的关系

目的探讨早期糖尿病肾病患者血尿泛素核糖体融合蛋白52(UBA52)与尿白蛋白/尿肌酐比值(ACR)的关系。方法选择新疆医科大学第五附属医院2010年9月至2012年9月收治的糖尿病肾病患者59例(糖尿病肾病组),糖尿病患者20例(糖尿病组),另外选取同期健康体检者22例(正常对照组),检验各组受试者身高、体质量、尿肌酐、血尿UBA52、尿微量白蛋白、ACR、β2微球蛋白、α1微球蛋白及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷(NAG)酶,计算ACR,比较血尿UBA52及各个相关指标在不同组间的差异,并采用相关分析及偏相关分析方法考察血尿UBA52与ACR的关系。结果糖尿病肾病组ACR、血尿Ub A52、尿α1微球蛋白、NAG酶高于正常对照组(P<0.05),糖尿病组尿α1微球蛋白、NAG酶高于正常对照组(P<0.05),糖尿病肾病组ACR、血尿Ub A52高于糖尿病组(P<0.05)。一般相关分析显示,尿UBA52与ACR、β2微球蛋白及NAG酶呈正相关,血UBA52与ACR呈正相关。剔除β2微球蛋白、α1微球蛋白及NAG酶干扰,偏相关分析结果显示,血尿UBA52与ACR仍呈正相关。结论早期糖尿病肾病患者血尿UBA52增多、ACR增高,两者呈正相关,提示早期糖尿病肾病患者UBA52表达增多与尿白蛋白增加有一定相关性。