常染色体显性多囊肾病中泛素连接酶β-TrCP的表达及其作用和调控机制

目的观察常染色体显性多囊肾病(ADPKD)患者及动物模型中泛素连接酶β-TrCP的表达,初步探讨人囊肿衬里上皮OX161细胞中β-TrCP的作用和调控机制。方法在OX161细胞内转染β-TrCP的siRNA,采用蛋白免疫印迹法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,MTT比色法检测吸光度;在OX161细胞中抑制JAK2/STAT3通路或转染STAT3质粒,采用蛋白免疫印迹法检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和β-TrCP的表达。收集ADPKD行肾脏切除术患者的肾脏组织和肾旁距癌组织5 cm以上的正常肾脏组织(正常对照组)、雄性Han:SPRD(cy/+)大鼠(ADPKD模型)和野生型Han:SPRD(+/+)大鼠肾组织(对照),均采用蛋白免疫印迹法检测β-TrCP的表达。收集Pkdlflox/flox;tamoxifen-Cre+小鼠(ADPKD模型)和Pkdlflox/flox;tamoxifen-Cre-小鼠(对照)肾组织,采用免疫组织化学法检测β-TrCP的表达和亚定位。结果与UCL93细胞相比,OX161细胞中JAK2/STAT3通路明显活化,β-TrCP表达量增加;β-TrCP敲减后细胞增殖减慢(P<0.05);WP1006抑制JAK2/STAT 3通路后,β-TrCP表达量减低,转染STAT 3质粒后,β-TrCP的表达量增加。与正常对照组、野生型Han:SPRD(+/+)大鼠及Pkdlflox/flox;tamoxifen-Cre-小鼠比较,ADPKD患者肾组织、Han:SPRD(Cy/+)大鼠肾组织及Pkdlflox/flox;tamoxifen-Cre+小鼠肾组织中β-TrCP表达量明显增加。结论在人囊肿衬里上皮OX161细胞株中β-TrCP表达量增多,且受JAK2/STAT3通路调控;在ADPKD患者及其模型鼠肾脏组织中β-TrCP表达量也增加。β-TrCP可能参与促进囊肿的发生和发展。

泛素连接酶β-TrCP降角翠BCR-ABL融合蛋白对白血病K562细胞增殖的抑制

目的:t(9;22)(q34;q11)突变导致的BCR-ABL融合基因及其编码的融合蛋白在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病中发挥重要作用。本研究观察可与BCR-ABL融合蛋白N端寡聚化区域(Oligomerization domain,OD)特异性结合的嵌合泛素连接酶E3 β-TrCP的β-TrCP-OD-HA的重组腺病毒载体,经泛素-蛋白酶体途径降解BCR-ABL融合蛋白对白血病K562细胞增殖的影响。方法:HEK293细胞扩增野生型Ad5β-TrCP-OD-HA、突变型Ad5ΔF-TrCP-OD-HA及空载Ad5GFP重组腺病毒载体,感染K562细胞。以未感染K562细胞作空白对照,流式细胞术检测重组腺病毒载体感染效率,Western blot检测外源性重组蛋白和BCR-ABL融合蛋白的表达,通过细胞增殖曲线、甲基纤维素集落形成试验、细胞周期检测β-TrCP-OD-HA对K562细胞增殖的影响。结果:成功建立携β-TrCP-OD-HA重组腺病毒载体的K562细胞株,重组腺病毒载体感染效率达66.4%以上,β-TrCP-OD-HA、ΔF-TrCP-OD-HA可在K562细胞中表达。三组重组腺病毒载体感染K562细胞后,Ad5β-TrCP-OD-HA组Western blot检测BCR-ABL融合蛋白含量下降;K562细胞生长和集落形成能力均受抑制;细胞周期显示S期细胞数下降至10.88%±2.42%、G_0/G_1期升高至85.6%±5.61%,与Ad5β-TrCP-OD-HA组、Ad5GFP组及对照组相比,差异具有统计学意义(P均<0.05)。结论:重组腺病毒介导的β-TrCP-OD-HA、ΔF-TrCP-OD-HA能够在白血病K562细胞中表达;β-TrCp-OD-HA可以抑制K562细胞的生长增殖,其机制可能与其降解BCR-ABL融合蛋白、阻滞细胞周期而实现。

E3泛素连接酶β-TrCP1在肿瘤中的研究进展

β-转录重复包含蛋白1(β-transducin repeat containing protein 1,β-TrCP1)是一种E3泛素连接酶的底物识别亚基,能特异性识别泛素化底物,在细胞增殖、信号转导以及细胞周期进程中发挥重要作用。β-TrCP1蛋白表达异常或功能失调常使泛素化修饰异常,影响多种肿瘤的发生、发展。该文现对β-TrCP1在恶性肿瘤中的作用及相关分子机制进行综述。

三孢布拉霉CrgA泛素连接酶功能的初步探究

CrgA已经被证实是三孢布拉霉和一些其他丝状真菌中类胡萝卜素生物合成的一个负调控因子。环指结构域的存在表明,CrgA可能具有泛素连接酶的功能,是泛素化调节系统中的一个关键酶。为了验证这一假设,从三孢布拉霉中分离并鉴定了一种泛素激活酶(BtE1)和18种假定的泛素结合酶(UBC)。生物信息学分析表明,18种UBC蛋白质都包含一个UBC的保守结构域,表明它们都属于泛素结合酶。系统发育关系分析表明,18个UBC蛋白质属于7个蛋白质亚家族。根据系统进化分析结果筛选出6种候选UBC蛋白质,通过异源表达及亲和纯化得到BtE1、6种BtUBC蛋白质、BtCrgA和BtWC-1b,并在体外进行泛素化反应,BtCrgA能在BtE1和BtUBC D的协助下完成对自身的泛素修饰功能。

水稻泛素连接酶D3与抗病相关蛋白VOZ2的互作分析

多蘖矮秆基因dwarf-3(D3)是水稻独脚金内酯信号转导过程中的重要节点基因,拟南芥中的MAX2基因与D3同源,且MAX2参与拟南芥的抗病防卫反应。本研究以水稻泛素连接酶D3为诱饵进行酵母双杂筛库,发现水稻抗病相关蛋白维管植物单锌指蛋白VOZ2与D3存在潜在的相互作用。通过酵母双杂交试验证实,D3与VOZ2存在互作。通过荧光定量PCR证实,接种水稻白叶枯病菌后,VOZ2基因在转录水平上的表达受到显著诱导。利用水稻原生质体开展的亚细胞共定位实验发现,D3与VOZ2共定位于细胞核。双分子荧光互补实验发现,D3与VOZ2在烟草叶肉细胞的细胞核和细胞质均产生较强的荧光,进一步证实了D3与VOZ2的相互作用。研究结果为进一步探究D3和VOZ2在水稻抗病防卫反应中的功能与分子机理奠定了基础。

泛素连接酶MuRF2通过抑制线粒体自噬减轻心肌细胞缺氧损伤

目的探讨泛素连接酶肌肉环指状蛋白2(muscle ring finger protein 2,MuRF2)对缺氧心肌细胞活力和自噬的调控作用。方法构建大鼠源MuRF2基因过表达和敲减慢病毒载体,分别感染大鼠心肌细胞H9C2。将H9C2细胞分为阴性对照组(NC)、阳性对照组[MuRF2过表达空载体组(LV-Vector)、MuRF2敲减空载体组(LV-RNAi-Vector)]、Mu RF2过表达组(LV-MuRF2)和MuRF2敲减组(LV-RNAi-MuRF2),缺氧培养(5%CO_(2)、1%O_(2)、94%N_(2))后,采用CCK-8法和ELISA法检测心肌细胞损伤水平,利用透射电子显微镜检测心肌细胞超微结构和自噬水平变化,采用Western blot测定自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和P62的表达水平。结果与对照组相比,缺氧组心肌细胞间隙增大、细胞皱缩、多见漂浮的死亡细胞和细胞碎片,心肌细胞活力下降、肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)含量增加(P均<0.05);电子显微镜下可观察到部分线粒体发生肿胀,并存在嵴断裂、嵴溶解现象,自噬小体散在胞质内;缺氧组LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高,P62蛋白表达水平降低(P均<0.05)。缺氧培养后,与NC组和LV-Vector组相比,LV-MuRF2组细胞活力增加,偶见自噬小体,LC3-Ⅱ蛋白表达水平降低、P62蛋白表达水平增高(P均<0.05);与NC组和LV-RNAi-Vector组相比,LV-RNAi-MuRF2组细胞活力降低,可见大量自噬小体,LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高、P62蛋白表达水平降低(P均<0.05)。结论泛素连接酶MuRF2可减轻缺氧所致的心肌细胞损伤,其机制可能与抑制心肌细胞线粒体自噬有关。

甜菜应答盐胁迫的E3泛素连接酶UPL家族基因的鉴定与分析

甜菜为二年生草本植物,是我国重要的糖料作物,广泛种植于我国东北、西北和华北等地区。本文以甜菜T710-Mu品系为试验材料,利用盐胁迫下的甜菜转录组数据库,通过建立隐马尔科夫模型筛选数据库得出3个响应盐胁迫的含有HECT结构域的UPL(Ubiquitin-protein ligase)家族基因。对3个UPL家族基因编码的蛋白质BvUPL3、BvUPL4和BvUPL5进行蛋白质理化性质预测、进化关系分析、蛋白质保守结构域分析和蛋白质互作网络等生物信息学分析。预测BvUPL3、BvUPL4和BvUPL5分别分布在Chr09、Chr07和Chr08,并且具有典型的HECT型结构域,鉴定得到的编码E3泛素连接酶UPL基因属于UPL家族基因。蛋白质互作预测结果表明,这些UPL蛋白质之间存在相互作用,并可能与泛素蛋白酶体系统中其他组分,如泛素藕合因子、E2共价结合酶以及26S蛋白酶体等相互影响。结合荧光定量PCR和转录组数据结果可知,BvUPL3基因在叶片和根部的相对表达量与对照组相比显著上升,BvUPL4和BvUPL5基因的相对表达量与对照组相比在叶片中显著下调,在根部显著上升,这些结果可为后续深入研究甜菜泛素连接酶提供理论基础。

SCF泛素连接酶的体外泛素化体系构建与检测

为研究蛋白质的体外泛素化过程,利用大肠杆菌表达系统异源表达和纯化APPBP1/UBA3(E1)、UBC12(E2)、Cullin1-Rbx1(E3)和Nedd8(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 8)蛋白,制备FITC-Cysteine绿色荧光素标记的泛素Ub(Ubiquitin),构建了SCF泛素连接酶的体外泛素化体系,同时实现快速检测SCF泛素连接酶中Cullin1蛋白的自泛素化修饰。结果表明,建立的体外SCF E3自泛素化活性反应体系具有较高的可操作性和便利性。

泛素连接酶E3在结直肠癌转移中作用的研究进展

结直肠癌发生转移的患者预后差、5年生存率低。泛素连接酶(E3)是泛素蛋白酶体系统的重要组成部分,可特异性识别蛋白质底物,从而依赖泛素化降解多种蛋白质以维持体内蛋白质稳态。E3通过调控细胞增殖、凋亡及细胞周期等细胞生命活动在多种肿瘤转移相关生物学过程中发挥重要作用,归属于相同类别的E3可对结直肠癌转移起促进或抑制作用。

SCF^(β-TrCP)泛素化降解TFAP4抑制结直肠癌上皮间质转化的分子机制研究

目的 探究SCF^(β-TrCP)泛素化降解转录因子激活增强子结合蛋白4(transcription factor-activated enhancer-binding protein 4, TFAP4)对结直肠癌上皮间质转化的影响。方法 体外培养人结肠腺癌细胞SW480,分别用不同浓度的MLN4924处理24h,然后采用Western blot法检测内源性TFAP4蛋白水平变化。在MLN4924处理的基础上,加入CHX分别干预不同时间,检测TFAP4的蛋白半衰期和泛素化水平差异。在CHX干预的SW480细胞中过表达带FLAG标签的TrCP-1,探究β-TrCP对TFAP4表达的影响,通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)实验检测过表达或敲低β-TrCP不是因为影响了其他信号通路而改变TFAP4的水平。将TFAP4上135位的E突变为A,139位的S突变为A,然后在CHX干预的SW480细胞中转染结构域突变的TFAP4,测定TFAP4半衰期和泛素化水平变化。CK1/CK2/GSK3磷酸化关键酶抑制剂对SW480细胞进行干预,Western blot法检测TFAP4水平,随后检测CK2抑制剂对TFAP4泛素化水平的影响,通过划痕实验分析细胞迁移能力,通过Transwell实验分析细胞侵袭能力。结果 TFAP4随着MLN4924处理浓度变化呈剂量依赖式增加,MLN4924处理能够显著延长内源TFAP4蛋白的半衰期,TFAP4和CK2存在相互作用,CK2抑制剂能降低TFAP4泛素化水平,蛋白的半衰期得到明显延长,敲低β-TrCP引起TFAP4的降解受到明显抑制,β-TrCP与TFAP4直接相互作用,并促进其被泛素化,TFAP4中E135A和S139A位点突变延长其半衰期,沉默β-TrCP能促进细胞增殖和迁移。结论 SCF^(β-TrCP)可能通过泛素化修饰降解TFAP4,从而抑制结直肠上皮间质转化的发生,进而抑制肿瘤的浸润、转移,可为结直肠癌治疗提供新的思路。

泛素连接酶和去泛素化酶在帕金森病中的作用

中脑黑质多巴胺能神经元特异性损伤和α突触核蛋白聚集的分子机制是帕金森病(Parkinson’s disease,PD)研究领域亟待解决的问题。蛋白质异常聚集很大程度上是由于泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)功能障碍引起的。蛋白质泛素化由一系列泛素化酶级联反应促进,并受去泛素化酶(deubiquitylases,DUBs)的反向调节。泛素化和去泛素化过程异常导致蛋白质异常聚集和包涵体形成,进而损伤神经元。近来研究报道,蛋白质的泛素化和去泛素化修饰在PD的发病机制中发挥重要作用。E3泛素连接酶促进蛋白质的泛素化,有利于α突触核蛋白的清除、促进多巴胺能神经元的存活、维持线粒体的功能等。DUBs可以去掉底物蛋白质的泛素化修饰,抑制α突触核蛋白的降解,调控线粒体的功能和神经元内铁的稳态。本文以E3泛素连接酶和DUBs为切入点,综述了蛋白质泛素化和去泛素化修饰参与多巴胺能神经元损伤机制的最新研究进展。

E3泛素连接酶在结直肠癌中的作用机制研究进展

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)作为全球发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一,其致病机制十分复杂,至今尚未完全阐明。泛素化在CRC的发生发展过程中扮演重要角色,其调控作用主要依赖于E3泛素连接酶泛素化修饰底物蛋白使之活性改变或发生泛素—蛋白酶体降解。该文就RING(really interesting new gene)型和HECT(homologous to E6AP C-terminus)型E3泛素连接酶在CRC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及化疗敏感性中的作用机制及这两类E3泛素连接酶的靶向抑制剂相关研究进展作一综述,为CRC致病机制研究及其靶向治疗提供新的思路。

线粒体泛素连接酶1对大鼠心肌细胞H9C2缺氧损伤的实验研究

目的 观察线粒体泛素连接酶1(mitochondrial ubiquitin ligase 1,Mul1)对心肌细胞缺氧损伤的影响。方法构建大鼠源Mul1基因过表达和敲减的慢病毒载体,分别转染大鼠心肌细胞H9C2。将阴性对照组、Mul1过表达组、Mul1过表达空载体组、Mul1敲减组和Mul1敲减空载体组细胞分别进行常规培养(5%CO_(2)、21%O_(2))和缺氧培养(5%CO_(2)、94%N_(2)、1%O_(2))后,利用倒置显微镜观察各组细胞形态变化,利用CBM智能细胞检测平台动态观察细胞存活率,透射电镜观察心肌细胞超微结构。结果 与相应的各常规培养组相比,缺氧培养后各组H9C2细胞存活率均下降、细胞形态明显改变,细胞器受到损伤。缺氧培养后,与阴性对照组和Mul1过表达空载体组相比,Mul1过表达组细胞状态差,细胞存活率下降(P均<0.05);Mul1敲减组与阴性对照组和Mul1敲减空载体组相比细胞状态较好,存活率上升(P均<0.05);电镜观察结果显示,与阴性对照组和Mul1过表达空载体组相比,Mul1过表达组细胞结构损伤加重,大部分线粒体嵴断裂或溶解呈空泡状、胞质内容物明显减少;Mul1敲减组细胞结构损伤程度较阴性对照组和Mul1敲减空载体组减轻,大部分线粒体结构正常,偶见嵴断裂现象。结论 Mul1可加重缺氧诱导的心肌细胞结构损伤,使心肌细胞存活力下降。

NEDD4泛素连接酶家族在骨质疏松症中的研究

骨质疏松症的重要发病原因是骨重塑过程的紊乱,而介导泛素化的NEDD4泛素连接酶家族在这一过程中扮演着关键的角色。其中泛素连接酶Smurf1、Wwp1能够抑制成骨细胞分化,Smurf2则能够抑制促破骨细胞分化因子RANKL的分泌,而Wwp2却是一种成骨的正向促进因子。近年来,有关NEDD4泛素连接酶家族的研究为骨质疏松症的发病机制和治疗提供了许多新的方向。本篇综述总结了NEDD4泛素连接酶家族在骨重塑过程中的调控作用。

大豆E3泛素连接酶基因GmHOS1a和GmHOS1b生物信息学分析和敲除载体构建

HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLLY RESPONSIVE GENES 1(HOS1)是植物中多种信号途径的整合因子,在植物发育、胁迫反应、光形态建成和开花调控中发挥至关重要的作用,是很有潜力的作物工程育种目标基因,但其在大豆中的功能尚未被揭示。为了揭示其在大豆中的功能,本研究利用反向遗传学,成功克隆了两个大豆HOS1基因,GmHOS1a和GmHOS1b,并通过生物信息学技术,对其蛋白结构、表达模式和功能进行了分析。进化树和结构域分析表明,GmHOS1a和GmHOS1b具有N端的环指结构域和与ELYS高度相似的保守基序,与拟南芥和水稻HOS1蛋白高度同源。亚细胞定位结果显示,GmHOS1a和GmHOS1b定位在细胞核中。Quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)结果表明,GmHOS1a和GmHOS1b的基因表达模式相似,均在三出复叶中高度表达。48 h光周期RNA-sequencing(RNA-seq)和qRT-PCR分析表明,GmHOS1a和GmHOS1b基因的表达具有生物钟昼夜节律性,其中GmHOS1a的表达量显著高于GmHOS1b,GmHOS1a见光后表达量升高,黑暗前表达量达到峰值。为进一步探索GmHOS1a和GmHOS1b蛋白的功能,利用CRISPR/Cas9系统构建了9个GmHOS1a和GmHOS1b基因敲除载体,通过发根检测实验,筛选出6个高效工作载体,可供后续遗传转化实验使用。本研究为阐明该基因的功能和作用机理奠定了理论基础,并提供了可供遗传转化的载体材料。

miR-146b-5p靶向E3泛素蛋白连接酶促进高糖诱导的小鼠腹膜间皮细胞上皮间质转化

目的探讨miR-146b-5p与E3泛素蛋白连接酶(ZNRF3)对高糖诱导的小鼠腹膜间皮细胞上皮间质转化(EMT)进程的影响及作用机制。方法正常培养的小鼠为对照组,采用4.25%葡萄糖透析液和0.1 mg/kg的脂多糖诱导腹膜纤维化小鼠模型,收集小鼠腹膜组织,Masson染色观察腹膜组织胶原纤维变化,免疫组化法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(COL I)表达。Western blot检测腹膜组织上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、α-SMA和COL I表达。qRT-PCR检测腹膜组织中miR-146b-5p和ZNRF3表达。双荧光素酶报告基因检测验证miR-146b-5p和ZNRF3靶向关系。分离对照组小鼠腹膜间皮细胞,高糖诱导构建小鼠腹膜间皮细胞纤维化模型,将细胞分为对照组、模型组、mimic-NC组、miR-146b-5p-mimic组和miR-146b-5p-inhibitor组。Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力。Western blot检测EMT相关蛋白表达。结果与对照组小鼠比较,模型组小鼠腹膜组织增厚,胶原纤维增多,α-SMA和COL I表达增加(P<0.05),miR-146b-5p表达升高(P<0.05),E-cadherin和ZNRF3表达降低(P<0.05)。miR-146b-5p靶向负调控ZNRF3表达。细胞水平检测结果显示,与对照组比较,模型组和mimic-NC组小鼠腹膜间皮细胞迁移和侵袭细胞数增多(P<0.05),E-cadherin表达降低(P<0.05),波形蛋白(Vimentin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达升高(P<0.05)。与模型组比较,miR-146b-5p-mimic组小鼠腹膜间皮细胞变化趋势更为显著,miR-146b-5p-inhibitor组细胞EMT进程受到抑制。结论miR-146b-5p可靶向ZNRF3基因促进高糖诱导的小鼠腹膜间皮细胞EMT进程。

泛素连接酶SMURF1催化ADAR1的多聚泛素化修饰

既往研究发现,SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1,SMURF1)通过其E3泛素连接酶活性介导自噬进程,然而SMURF1的泛素化底物蛋白质仍有待进一步挖掘。本文利用免疫共沉淀(Co-IP)联合蛋白质谱分析捕获并鉴定THP-1细胞中SMURF1的相互作用蛋白质集合物,发现在THP-1细胞中SMURF1可与222种蛋白质物理性结合,RNA腺苷脱氨酶1(adenosine deaminase acting on RNA 1,ADAR1)具有较高的肽段结合分数。构建SMURF1过表达载体并转染到HEK-293T细胞中,Co-IP和Western印迹检测验证外源性SMURF1与内源性ADAR1存在相互作用。qRT-PCR和Western印迹检测结果显示,在HEK-293T细胞中过表达SMURF1后ADAR 1 mRNA水平差异无统计学意义、蛋白质水平明显降低(P<0.05)。用放线菌酮(CHX)分别处理正常和过表达SMURF1的HEK-293T细胞,Western印迹检测显示,过表达SMURF1后ADAR1的半衰期缩短(P<0.05)。进一步在HEK-293T细胞中共转染泛素(Ub)过表达载体和SMURF1过表达载体,通过Co-IP和Western印迹检测结果证实,过表达SMURF1后ADAR1的多聚泛素化水平显著增加(P<0.05)。在蛋白酶体抑制剂(MG132)作用后,Western印迹检测结果表明,蛋白酶体降解途径受抑制后SMURF1对ADAR1的负调控作用减弱(P<0.05)。本研究表明,SMURF1可以与ADAR1相互作用,催化ADAR1的多聚泛素化修饰并介导其蛋白酶体途径降解,为探索SMURF1通过影响ADAR1蛋白质稳定性而具备的多种生物学功能提供理论基础。

青花菜E3泛素连接酶基因的克隆及表达分析

为探讨泛素蛋白酶体在高温胁迫下参与蛋白质降解途径相关的生理过程和功能,以青花菜‘KUQ19⁃27’为试验材料进行高温胁迫(38℃)处理,设计特异性引物从青花菜中克隆得到青花菜E3泛素连接酶基因并进行生物学信息分析,并运用实时荧光定量PCR技术分析其表达特征.结果显示:E3泛素连接酶基因的ORF长度为1332 bp,编码443个氨基酸,相对分子量为48.3 kD.亲疏水性分析结果表明:在多肽链中第207位氨基酸时,亲水性最高,为3.38;在肽链中第280位氨基酸时,疏水性最高,为-4.23,是疏水性蛋白.在青花菜E3泛素连接酶基因氨基酸序列中,其C、Y、S值均小于0.5,由此预测其不具有信号肽,不属于分泌蛋白.系统进化分析表明青花菜E3泛素连接酶基因与其他物种,比如拟南芥、草莓、月季、葡萄等苷核酸序列相似性都在60%以上,同甘蓝、油菜、白菜和拟南芥的进化关系较近,同草莓、月季、菜豆、葡萄、刺菜蓟、芝麻和水桔梗的进化关系较远,与其他物种,如拟南芥、草莓、月季、葡萄等核苷酸序列相似性都在60%以上.荧光定量PCR技术结果表明高温处理3 h时,青花菜E3泛素连接酶基因表达量下调30%,胁迫12 h时表达量持续下降仅为对照的20%.研究结果可为进一步深入探讨青花菜E3泛素连接酶的高温胁迫响应机制提供一定的理论依据.

甘蔗E3泛素连接酶基因PRT1的生物信息学及表达模式分析

为探究甘蔗PROTEOLYSIS 1(PRT1)基因与黑穗病菌的互作关系,以甘蔗割手密种和栽培品种为研究对象,通过RT-PCR技术对ScPRT1(GenBank登录号:MT747433)基因进行克隆,生物信息学分析、定量PCR、亚细胞定位和基因共表达网络分析。生物信息学分析表明,该基因的cDNA全长为1621 bp,包含一个长度为1260 bp,编码419个氨基酸的完整开放读码框;其编码蛋白的分子量为46.56 ku,为酸性、不稳定的亲水蛋白,无信号肽,具有核定位信号;该蛋白包含2个RING结构域和1个ZZ结构域;ScPRT1蛋白的高级结构元件多为无规则卷曲。定量PCR结果显示,ScPRT1在皮、叶片、芽中的表达量相差不大,在蔗髓中表达量最高。同时该基因的表达受脱落酸胁迫后显著上调;受黑穗病菌胁迫后,在甘蔗抗黑穗病品种中上调表达,在感黑穗病品种中下调表达,都达到了显著水平。亚细胞定位结果揭示,ScPRT1定位于细胞核。寄主甘蔗和病原黑穗病菌的基因共表达网络中,与甘蔗ScPRT1共表达的黑穗病菌基因中,有3个为N端具有芳香族氨基酸残基的黑穗病菌效应蛋白,这暗示它们之间存在直接的相互作用。以上结果表明,ScPRT1在甘蔗激素信号传导以及响应黑穗病菌侵染过程中发挥重要作用。

‘无子瓯柑’E3泛素连接酶基因CsRNF217对转基因烟草育性的影响

【目的】为了验证‘无子瓯柑’Citrus suavissima‘Seedless’E3泛素连接酶基因CsRNF217对雄蕊育性的影响,采用异源转化获得过表达CsRNF217的转基因烟草Nicotiana tabacum,分析其对烟草育性的影响。【方法】采用亚历山大染色法、花粉离体培养法、杂交授粉后的结实率分析野生型烟草及转基因烟草自交1代(T1)阳性株系的花粉活力及胚囊育性,利用半定量RT-PCR分析基因CsRNF217在转基因烟草T1阳性株系花药中的表达强弱。【结果】‘无子瓯柑’CsRNF217在转基因烟草自交T1株系中高效表达,转基因株系的花粉染色活力和离体萌发率、自交结实率、以及与野生型的正反交结实率均显著低于野生型(P<0.05)。【结论】过表达CsRNF217的烟草植株花粉育性显著下降,同时伴随胚囊育性下降的现象,推测CsRNF217基因对‘无子瓯柑’雌雄育性存在负向调控的作用。