笃斯越橘E3连接酶基因VuARI2的克隆及其抗寒功能分析

【目的】通过克隆笃斯越橘E3泛素连接酶基因VuARI2及分析其在拟南芥中异源表达,探索笃斯越橘VuARI2基因在低温胁迫响应中的功能。【方法】以笃斯越橘为材料,用RT-PCR和RACE技术从茎中克隆获得VuARI2基因,并对其进行系统生物信息学分析;用qRT-PCR技术分析该基因在不同组织中及低温胁迫处理下的表达模式;在拟南芥中异源表达VuARI2并对其进行冷驯化后表达水平、生理指标及冰冻处理后的抗寒性分析。【结果】VuARI2基因编码区长1770 bp,编码589个氨基酸。泛素连接酶VuARI2与野山茶、咖啡树、葡萄和河岸葡萄ARI2蛋白的氨基酸序列同源关系较近。qRT-PCR结果显示,VuARI2基因表达具有组织特异性,在叶和花芽中VuARI2的表达量显著高于根和茎中;茎和花芽VuARI2表达受低温诱导较显著。转基因植物的VuARI2基因表达量在冷驯化后显著高于野生型;总叶绿素含量降幅显著低于野生型;脯氨酸和可溶性糖含量显著高于野生型;超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性均显著高于野生型,而相对电导率和丙二醛含量显著低于野生型。冷驯化后转基因植物在冰冻低温下存活率显著高于野生型,相对电导率显著低于野生型,提高了植物抗寒性。【结论】克隆获得了笃斯越橘VuARI2基因,过表达VuARI2基因可以提高植物抗寒性。

向日葵E3泛素连接酶基因的分析定位和表达鉴定

该研究利用前期获得的向日葵耐盐相关基因E3泛素连接酶基因序列(HERC2),构建瞬时表达载体Cam-35S-HERC2-GFP,采用基因枪法转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位;采用RT-PCR技术,分析盐胁迫下HERC2在耐盐品种P50和盐敏感品种P29根、下胚轴和叶中的表达差异;构建HERC2植物表达载体pPZP221-HERC2,采用农杆菌介导法将HERC2导入烟草,进行耐盐功能验证。结果表明:(1)HERC2蛋白定位在细胞膜、细胞质和细胞核中。(2)受到NaCl胁迫后,HERC2基因在耐盐品种P50和盐敏感品种P29中均上调表达,但耐盐品种中的表达量较高。(3)HERC2基因的表达,能够提高转基因烟草的耐盐性。该研究结果为进一步解析向日葵对盐胁迫的响应机制,以及耐盐新品种的选育奠定了基础。

hCDC14A与BRAP2相互作用的初步研究

目的:筛选hCDC14A(human cell division cycle gene14A)的相互作用蛋白,探索功能联系。方法:酵母双杂交筛选hCDC14A的可能相互作用蛋白,Pulldown实验和免疫共沉淀实验验证蛋白质间相互作用,免疫荧光显微镜观察目的基因在细胞中的表达和定位,体内泛素化实验提示可能的相互作用机制。结果:酵母双杂交筛查到BRAP2(BRCA1 associated protein2)为hCDC14A的可能相互作用蛋白,两者有共同定位,BRAP2可以增强hCDC14A的泛素化修饰。结论:BRAP2可以与hCDC14A相互作用,可能是hCDC14A的泛素连接酶。

隔药饼灸调节大鼠免疫抑制机制的转录组测序分析

背景:免疫抑制会导致机体免疫功能受损,加重病情。隔药饼灸能有效调节机体免疫功能,提高机体免疫力,但其调节机制目前仍不清楚。目的:基于转录组学的生物信息学技术对隔药饼灸干预的免疫抑制模型大鼠进行测序,探究隔药饼灸调控免疫的机制。方法:将24只SD大鼠随机分为空白组、模型组和隔药饼灸组,每组8只,模型组与隔药饼灸组采用腹腔注射环磷酰胺制备免疫抑制模型,35 mg/kg,连续3 d,造模结束后空白组与模型组不做干预,隔药饼灸组在大鼠中脘、神阙、关元及足三里穴位进行艾炷与药饼结合的隔药饼灸干预,连续10 d,1次/d,干预结束后次日取材。取各组大鼠外周血进行白细胞数量检测;采用Illumina测序平台进行RNA-seq,筛选差异基因,结合GO与KEGG数据库,对差异基因进行生物信息学相关分析。结果与结论:①与空白组比较,模型组白细胞数量显著减少(P<0.001)。②RNA-seq共筛选出模型组与空白组间差异基因3026个,其中1565个上调、1461个下调,隔药饼灸组与模型组间差异基因535个,其中280个上调、255个下调。③韦恩图分析获得模型组与空白组159个下调基因经隔药饼灸干预后上调,蛋白互作网络分析获得Oasl,Oas2,Isg15,Herc6,Mx2,Helz2,Mx1,Syk,Hspa1a及Ret等10个核心靶点;④GO与KEGG分析隔药饼灸调节机体的机制有免疫应答途径、病毒相关、血管新生和自身免疫系统等通路。⑤上述结果证实,实验筛选出隔药饼灸干预免疫抑制与Oasl,Oas2,Isg15,Herc6,Mx2,Helz2及Mx1靶点有明显关联,并且在免疫应答、病毒相关及血管新生等通路中发挥调控作用。

Skp2 knockout reduces cell proliferation and mouse body size： and prevents cancer？

Attaching multiple ubiquitins （a 76- residue protein ubiquitously expressed in eukaryotic cells） covalently to a protein labels that protein for degradation in the proteasome （a large tunnel-like complex considered as a protein degradation factory）. There are many types of ubiquitin ligases （the enzymes that carry out the protein ubiquitination reactions）; one of them is the Culin-R1NG ubiquitin ligase （CRL）. There are six Culin proteins and two RING proteins, forming six general types of Culin-RING core platforms for various substraterecruiting subunits to complete the formation of substrate-specific CRLs.

泛素结合酶UBE2T基因在肝癌细胞迁移和侵袭中的作用及其临床意义

目的:探讨泛素结合酶E2 T(ubiquitin conjugating enzyme E2 T,UBE2T)在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义,并研究UBE2T基因表达在肝癌细胞迁移和侵袭过程中的作用。方法:采用实时荧光定量PCR法检测54对肝细胞癌及相应癌旁肝组织中UBE2T mRNA的表达水平。应用免疫组织化学法检测233例肝细胞癌组织中UBE2T蛋白的表达水平,并分析UBE2T表达与患者临床病理参数之间的关系。构建含有UBE2T基因序列的pWPXL重组慢病毒载体(pWPXLUBE2T)并将其转染肝癌Hep3B和SMMC-7721细胞系,另一方面将靶向UBE2T基因的shRNA慢病毒载体(GV248-shUBE2T-1和GV248-shUBE2T-2)及阴性对照慢病毒载体(GV248-NC)转染肝癌MHCC-LM3和SK-Hep1细胞系,采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法验证UBE2T基因过表达和干扰效率,然后采用Transwell小室法分别检测UBE2T基因过表达和干扰表达对肝癌细胞迁移和侵袭的影响。结果:54对肝细胞癌组织中UBE2T mRNA表达水平明显高于相应癌旁肝组织(P<0.000 1)。在233例肝细胞癌组织中,UBE2T高表达与肝细胞癌的肝内转移有关(P=0.004)。与对照组相比,过表达UBE2T基因能够明显促进肝癌细胞Hep3B和SMMC-7721的迁移与侵袭(P值均<0.01)。与阴性对照组相比,干扰UBE2T基因表达能够明显抑制肝癌细胞MHCCLM3和SK-Hep1的迁移与侵袭(P值均<0.05)。结论:肝细胞癌中UBE2T高表达与肿瘤肝内转移有关,而过表达UBE2T基因可以促进肝癌细胞的迁移和侵袭。

Skp2基因沉默对子宫内膜癌HEC-1A细胞p27蛋白表达及细胞增殖的影响

RNA干扰（RNAi）是一项新的使基因表达阻断的技术，一种广泛使体外基因失活或沉默的方法，足在转录水平抑制基因表达的一种研究基因功能的有力工具，不仅可用于研究基因功能，同时也为基因治疗提供丁一个新的重要技术。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase-associated protein2，Skp2）是泛素连接酶复合物的组成部分F-box蛋自家族成员之一，通过特异性结合磷酸化的底物，引起底物的泛素化降解，对细胞周期的调控起重要作用，在肿瘤研究中日益受到关注。

他视角

Skp2抑制剂，有望成为肿瘤防治新药物 近年来的研究显示，细胞衰老在肿瘤的发生和发展中起着很重要的作用。因癌基因或抑癌基因的缺失所致的细胞衰老，也一直认为是由p19Arf-p53通路所致。而近期的《自然》杂志中有研究指出，由Skp2基因失活所致的细胞老化，并不依赖于Arf—p53通路。Skp2E3泛素连接酶具有原癌基因活性，在人类癌症组织中经常可以发现其过表达。

番茄SlWD1基因的克隆及SlWD1与DDB1的相互作用

在真核生物中,CDT2作为一个WD40家族蛋白,是CUL4-DDB1 E3泛素连接酶复合体的重要组成部分.其主要功能是将CUL4-DDB1 E3泛素连接酶和靶向蛋白连接起来,从而实现靶蛋白的泛素化修饰.利用RT-PCR技术和3’RACE技术,本研究在番茄中克隆到一个与人类CDT2同源的基因,命名为SlWD1.通过对番茄SlWD1蛋白序列与其它模式生物的蛋白序列进行氨基酸保守结构域分析和同源性比对,发现SlWD1具有2个非常保守的WD40家族的DWD结构域.酵母双杂交和免疫共沉淀实验都证明,SlWD1与DDB1具有相互作用;实时定量RT-PCR分析证明,SlWD1基因在各个组织中都表达,为组成型表达,但是,在生殖器官中的表达量要明显比其它的组织高.