HECT类泛素连接酶对p53家族的调控作用

p53家族成员在细胞生长、组织发育及肿瘤形成等方面都具有十分重要的生物学功能,其自身受到严格调控,泛素化修饰就是其中非常重要的方式之一,作为泛素化过程中决定底物特异性的泛素连接酶E3作用则更加突出.泛素连接酶E3可以分为两类:RING(really interesting new gene)类和HECT(homologous to E6AP C-terminus)类E3.近年来,HECT类E3对p53家族的调控效应不断得到揭示.本文综述了HECT类E3在调控p53家族转录活性、稳定性方面的重要作用、分子机制以及其作用对生物体肿瘤形成和生长发育等产生的影响,为进一步完善p53家族调控网络,揭示HECT类E3在肿瘤发生发展及防治中的作用提供参考.

泛素连接酶APC/C和SCF复合物与肿瘤的关系

Ubiquitin ligases are an important component in ubiquitination system,which can recognize substrate proteins specially to promote their degradation.Closely related to the generation and development of many tumors,ubiquitin ligases can regulate the growth,differentiation and apoptosis of cells by influencing protein stability,which makes them a potential new target for tumor molecular therapy.There are many kinds of ubiquitin ligases,mainly including APC/C and SCF complex.This article will introduce the structures and functions of these two kinds of ubiquitin ligases and their roles in the tumor generation and development.

靶向Cullin-RING E3泛素连接酶的抗肿瘤策略及相关药物研发进展

Cullin-RING E3泛素连接酶(CRL)是泛素-蛋白酶体系统的重要组分,参与催化蛋白质的泛素化,促进随后的蛋白质降解,从而影响细胞周期、细胞凋亡、DNA复制、信号转导等多种细胞生理活动,且在多种肿瘤细胞中异常活化。以MLN4924为代表的拟素化抑制剂的成功研发有力地证实了CRL是可行的抗肿瘤靶点,具有很好的药物研发潜力。近年来,不断有新的研究通过高通量筛选、基于计算机辅助的虚拟筛选或基于结构的药物设计技术寻找特异的CRL抑制剂,但由于CRL复合物具有多种亚单位,呈蛋白-蛋白相互作用和多变的蛋白构象,缺乏典型的小分子药物结合位点等特性,其相关药物研发仍面临巨大挑战。截至目前,CRL小分子抑制剂主要以研究最为透彻的SCF泛素连接酶复合体的底物识别亚基F-box蛋白家族为靶点。此外,也发现数个通过靶向UBE2M-DCN1相互作用,特异性阻断CRL3/CRL1拟素化,从而抑制CRL3/CRL1泛素连接酶活性的小分子化合物。另一方面,也有CRL激动剂的报道,主要见于植物生长素吲哚乙酸和免疫调节性酰亚胺类药物。此外,靶蛋白水解嵌合体(PROTAC)是一项靶向蛋白-蛋白相互作用的新技术,其通过特异性小分子抑制剂链接一个CRL E3泛素连接酶来精确降解特定促癌靶蛋白,已成为近年来利用E3泛素连接酶设计抗肿瘤靶向药物的热点。

E3泛素连接酶CUL2在宫颈癌中的研究进展

泛素化是蛋白质翻译后调控的重要途径。作为体内最大的E3泛素连接酶家族,Cullin-Ring类E3泛素连接酶广泛参与调控机体内细胞周期蛋白和转录因子的降解。其中,CUL2作为骨架分子形成CUL2泛素连接酶复合物,在希佩尔-林道(von Hippel-Lindau,VHL)肿瘤抑制因子相关受体底物的泛素化降解中发挥重要的作用。目前,研究发现CUL2普遍参与肿瘤血管生成、细胞动力、免疫逃逸、细胞增殖及等肿瘤恶变机制的调控。综述CUL2在肿瘤发生中的作用机制及其与宫颈癌的关系,旨在为宫颈癌的诊断和治疗提供新的作用靶点。

MARCH1在多器官功能障碍综合征病程中对脾脏树突细胞MHC-Ⅱ类分子泛素化作用的研究

目的观察多器官功能障碍综合征(MODS)小鼠脾脏树突细胞(DCs)中MARCH1和MHC-Ⅱ类分子的蛋白及mRNA表达情况,探讨MARCH1对MHC-Ⅱ类分子的泛素化调控作用。方法 110只C57BL/6小鼠随机分为1、3、5、7、10d组和正常对照组,前5个实验组小鼠采用腹腔注射酵母多糖法复制MODS模型(每组20只),正常对照组(10只)不做特殊处理。使用磁珠和Mini MACS分选磁场分离出小鼠脾脏DCs,分别采用Western blotting和Real Time PCR检测脾脏DCs中MARCH1和MHC-Ⅱ类分子的蛋白及mRNA表达情况,并观察其变化规律与病程的关系。结果脾脏DCs中MHC-Ⅱ类分子蛋白的表达在MODS 1d时即明显升高并达到峰值(P<0.05),而后逐渐下降,至10d时达到最低(P<0.05)。MHC-Ⅱ类分子mRNA的表达在整个病程中无明显变化(P>0.05)。MARCH1蛋白表达在MODS 1d时即显著降低(P<0.05),后开始回升,至7d时达到较高水平,而在10d时又再次下降,但与正常对照组相比,均无统计学差异。MARCH1 mRNA表达的变化与蛋白表达变化规律一致。结论在MODS病程中,MHC-Ⅱ类分子和MARCH1蛋白表达变化的趋势相反,MARCH1可能通过泛素化MHC-Ⅱ类分子来调控其表达水平,进而调控DCs的成熟状态及启动免疫应答反应。

泛素连接酶FBW7在胶质瘤的表达和作用分析

目的研究泛素连接酶FBW7在胶质瘤的表达情况,及其对胶质瘤细胞恶性生物行为的影响。方法应用免疫组织化学染色检测并定量分析FBW7在30例高级别、低级别胶质瘤的蛋白表达情况与表达差异。构建FBW7过表达慢病毒,并转染胶质瘤细胞株U251和U373,MTT法、细胞侵袭实验、划痕实验观察细胞增殖、侵袭和迁移。结果 FBW7在胶质瘤标本中的染色分数低于瘤旁脑组织,在Ⅳ级胶质瘤中的染色分数低于Ⅱ级(P <0.01);与肿瘤增殖标志Ki-67染色水平呈负相关(r=-0.4677)。过表达FBW7的U251和U373细胞增殖、侵袭和迁移能力显著抑制(P <0.01)。结论 FBW7表达随胶质瘤病理级别增加而下调,与增殖程度呈负相关,增加FBW7表达水平可抑制细胞恶性生物行为。

紫草素通过激活自噬相关的E1连接酶7信号通路诱导结肠癌细胞自噬

目的研究紫草素对人结肠癌细胞系SNU⁃407增殖和自噬的影响,及其潜在的分子机制。方法通过细胞计数试剂盒⁃8(CCK⁃8)检测细胞存活率,用Hoechst 33258染色法和流式细胞术分析细胞生长情况,采用蛋白质印迹法(Western Blot)分析不同紫草素浓度(0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和30μmol/L)处理前后自噬相关的E1连接酶7(ATG7)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和死亡受体(Caspase⁃8,Caspase⁃3,PARP)蛋白表达情况。结果紫草素以时间和剂量依赖性方式诱导SNU⁃407细胞凋亡和自噬,在紫草素处理的SNU⁃407细胞中观察到ATG7表达水平显著升高;与0μmol/L的紫草素相比,10μmol/L、20μmol/L和30μmol/L紫草素处理后SNU⁃407细胞的ATG7/自噬相关的E1连接酶5(ATG5)相对表达量分别显著增加[(176±9)%、(212±13)%和(293±11)%]。与GFPi(阴性对照质粒pSUPER_GFP siRNA)阴性对照组相比,ATG被沉默的shATG7(ATG7的RNA干扰质粒pSUPER_ATG7 siRNA)组LC3⁃Ⅱ/LC3⁃Ⅰ比值显著低于GFPi阴性对照组[(8.25±1.36)比(97.45±1.98),P<0.001],ATG7沉默后抑制了紫草素诱导的SNU⁃407细胞自噬;荧光显微镜结果和流式细胞术分析证实紫草素诱导结肠癌细胞凋亡;蛋白质印迹法印迹分析显示紫草素通过MAPK活化诱导结肠癌细胞凋亡,激活死亡受体(FADD)调节细胞凋亡蛋白(Caspase⁃8,Caspase⁃3,PARP)表达。此外,紫草素通过增加ATG7的表达水平,进而下调促进细胞自噬的p62表达。结论紫草素通过激活ATG7信号通路诱导人结肠癌细胞系SNU⁃407细胞凋亡和自噬.

人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10在大肠埃希菌中的诱导表达与鉴定

目的构建稳定表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C/UbcH10)蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导其表达,纯化并鉴定该重组蛋白。方法通过PCR扩增获得UbcH10基因,将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达载体,经EcoRI/XhoI双酶切及测序验证正确后,转化至大肠埃希菌BL21,经IPTG(终浓度1mmol/L)诱导表达4h。采用SDS-PAGE、Western blotting等方法鉴定表达产物,用Ni-Sepharose亲和层析和Sephadex G-50分子筛纯化UbcH10蛋白。结果成功构建UbcH10基因的原核表达载体,经IPTG诱导后在大肠埃希菌BL21中获得大量重组蛋白。该重组蛋白以可溶形式表达,表观分子量约为29kD,表达量约占菌体蛋白总量的40%。Western blotting检测在29kD附近出现预期条带,与目的蛋白的理论计算值相吻合。纯化后的UbcH10蛋白终浓度为8.82mg/ml,纯度达90%以上。结论成功表达并纯化了UbcH10重组蛋白,为进一步研究其结构、功能以及该蛋白在肿瘤发生发展过程中的作用奠定了基础。

泛素特异性蛋白酶在抗病毒感染免疫中的作用研究进展

泛素特异性蛋白酶（USP）属于半胱氨酸蛋白酶，是去泛素化酶家族的重要成员之一。USP家族分子通过多种途径正向或负向调控I型干扰素的产生，从而启动或削弱抗病毒感染免疫应答。例如USP2b、USP3、USP18、USP25、U136USP和HAUSP发挥抗病毒效应，而USP4、USP13、USP15和USP17则对机体的抗病毒免疫应答起负向调节的作用。本文对USP家族成员在抗病毒感染免疫应答中的调控作用及研究进展进行了综述。

蛋白泛素化修饰调控炎性肠疾病发生和发展的研究进展

炎性肠疾病是一种慢性胃肠道功能紊乱的炎症性疾病。泛素化是一类重要的蛋白质翻译后修饰方式。近年来关于泛素化-去泛素化系统在炎性肠疾病发生和发展中的作用已成为研究热点。目前蛋白泛素化修饰调控炎性肠疾病过程所需的E3泛素连接酶中,分子生物学研究较为清楚的有环指蛋白183(RNF183)、环指蛋白20(RNF20)、Itch和锌指蛋白A20。其中RNF183可靶向核因子κB抑制蛋白α(IκBα)泛素化降解促进NF-κB活化;RNF20促进组蛋白H2B单泛素化从而下调相关炎症因子的转录;Itch促进维甲酸核孤儿受体γt泛素化降解抑制IL-17介导的肠炎;A20以其特有的泛素化和去泛素化双重活性影响炎性肠疾病的发展。本文综述了以上分子在炎性肠疾病发生、发展和转归中的作用及调控机制。

HECT类泛素连接酶Smurf1自身调控机制的研究

目的泛素连接酶Smurf1在胚胎发育、骨形成调控和细胞极性控制中具有重要的生理功能,但是其自身的泛素化降解机制尚不清楚。本论文拟研究Smurf1分子间自我调控的机制,以期揭示一种新的泛素连接酶调控方式。方法通过免疫共沉淀实验确证了Smurf1分子间存在相互作用,体内泛素化、半衰期及降解实验研究了Smurf1的自身泛素化降解。结果 Smurf1存在分子间相互作用和泛素化降解,这种分子间的相互调控是由C2和WW结构域介导。结论 Smurf1分子间存在自我泛素化修饰及蛋白酶体依赖的降解,是一种新的HECT类泛素连接酶的调控机制。

蛋白泛素化修饰在心肌纤维化中的作用研究进展

近年来,中国心血管病患病率持续上升,心血管疾病病死率居于首位。临床上,心血管疾病在中老年群体中十分常见。多种心血管疾病与心肌纤维化有关,缺血性心脏病和心内膜心肌纤维化是终末期心力衰竭的主要原因[1]。在心肌受损时,心肌再生能力十分有限,主要表现为心肌成纤维细胞转化为肌成纤维细胞表型并导致心脏纤维化。

泛素蛋白酶体系统与心力衰竭

心力衰竭（heart failure ，HF）是由于心脏发生了结构和（或）功能异常，损害了心室的充盈和（或）射血能力而导致的复杂临床综合征，是各种器质性心脏病的终末共同通路。随着医学技术的发展，一些心脏基础疾病如冠心病、高血压等治疗水平有明显提高，但H F的患者却仍以每年200万的速度递增，故其已成为心脏病治疗的最后战场。泛素蛋白酶体系统（ubiquitin‐proteasome system ，UPS）是真核细胞内大多数蛋白质的降解通路，该系统的异常会导致许多疾病如肿瘤、神经变性疾病、自身免疫性疾病等的发生。近来研究发现，UPS与HF密切相关，可能参与了 HF的发展一些环节的调控。现就U PS与H F的关系作一综述。

泛素连接酶Pirh2与恶性肿瘤相关性的研究进展

泛素连接酶Pirh2(p53-induced RING-H2 protein)是一种具有E3连接酶活性的新蛋白,能促进p53发生泛素化而降解,从而使p53抑制肿瘤生长的功能减弱或消失,导致肿瘤发生和进一步恶化。近年来研究发现,多种恶性肿瘤中Pirh2蛋白的表达量有明显变化,这提示Pirh2在恶性肿瘤的发生、发展中可能具有重要的作用;Pirh2可能作为一个癌基因,在肿瘤发生过程中调节一些信号转导通路。因此,推测Pirh2可作为肿瘤基因治疗的一个潜在靶点。本文就Pirh2与恶性肿瘤相关性的最新研究进展作一简要综述。

晚期老年非小细胞肺癌患者外周血中泛素连接酶和髓样细胞白血病基因-1的表达与使用埃克替尼预后初探

目的 研究晚期非小细胞肺癌（NSCLC）老年患者外周血中泛素连接酶（FBW7）和髓样细胞白血病基因-1（MCL-1）的表达水平与使用埃克替尼预后的相关性. 方法 选择76例60岁以上的表皮生长因子受体（EGFR）突变敏感并且接受埃克替尼靶向治疗的晚期NSCLC老年患者,采用实时荧光定量PCR（RT-QPCR）检测每位患者外周血中FBW7和MCL-1基因表达水平,对两者的表达与临床病理因素、患者的总生存期（OS）、无进展生存期（PFS）相关性进行统计分析. 结果 FBW7和MCL-1的表达呈负相关（r=-0.37,P＜0.001）.外周血中FBW7高表达、MCL-1低表达的患者可以获得更高的有效率（P＜0.001）,更长的总生存期和无进展生存期.Cox回归分析发现外周血中FBW7和MCL-1的表达水平是影响OS和PFS的独立因素. 结论 FBW7高表达、MCl-1低表达的NSCLC患者更能从埃克替尼靶向治疗中获益,两者可作为埃克替尼疗效预判的指标,为临床埃克替尼应用提供支持和参考.

泛素连接酶Cbl-b在黑素瘤组织和细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义

目的：探讨泛素连接酶Cbl-b在皮肤黑素瘤组织及黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义。方法收集69份黑素瘤、30份色素痣组织，采用免疫组化法检测Cbl-b蛋白表达水平。实时荧光定量PCR、免疫印迹法分别检测黑素瘤细胞系A375、M14、MV3及黑素细胞中Cbl-b mRNA及蛋白表达水平。结果69份皮肤黑素瘤标本中，52份（75.36%）表达Cbl-b；30份色素痣标本中，4份（13.33%）表达Cbl-b，两组Cbl-b蛋白表达水平差异有统计学意义（χ2=32.745，P〈0.01）。黑素瘤组织中Cbl-b表达水平与肿瘤进展程度、Clark分级和Breslow厚度均呈正相关（rs分别为0.569、0.654、0.727，均P〈0.01）。实时荧光定量PCR显示，A375、M14、MV3细胞Cbl-b mRNA表达差异有统计学意义（F=176.537，P〈0.01）。免疫印迹法显示，A375细胞Cbl-b蛋白表达水平最高，黑素细胞最低。结论 Cbl-b蛋白在皮肤黑素瘤组织及其细胞株中均高表达。

嵌合泛素连接酶TrCP-CC及其突变体△F-CC重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建嵌合泛素连接酶TrCP-CC及其突变体△F-CC的重组腺病毒,并检测其表达。方法采用PCR和重叠PCR法构建真核表达质粒Migr1-TrCP-CC-HA和Migr1-△F-CC-HA,以此为模板,通过PCR将其克隆至穿梭质粒pAd-Track-CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-TrCP-CC和pAdTrack-△F-CC,再与骨架载体pAdeasy-1经同源重组得到重组腺病毒质粒pAd-TrCP-CC和pAd-△F-CC,转染HEK293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒Ad-TrCP-CC和Ad-△F-CC,测定其滴度,并经RT-PCR检测目的基因的转录水平。结果经酶切和测序证实重组腺病毒质粒pAd-TrCP-CC和pAd-△F-CC构建正确,经HEK293细胞包装后显微镜下可观察到绿色荧光,病毒滴度分别为2.5×109和1.0×109pfu/L,经RT-PCR检测目的基因可有效表达。结论已成功构建重组腺病毒Ad-TrCP-CC和Ad-△F-CC,并在HEK293细胞中成功表达,为进一步研究其靶向融合蛋白Bcr-Abl泛素化和降解的机制奠定了基础。

泛素连接酶CUL4A-DDB1复合体参与DNA损伤修复的研究进展

泛素化修饰在DNA损伤信号中发挥重要功能,包括细胞周期监控、DNA修复、细胞衰老和程序性死亡的调控。CUL4A-DDB1泛素连接酶通过DCAFs靶向调控特异性的底物,启动DNA切除修复机制对受损DNA进行修复。近期的研究表明CUL4A-DDB1泛素连接酶协助DNA修复因子与受损DNA的识别,来维持基因组的稳定性和正确性。

泛素连接酶Smurf1促进Smurf2的Nedd化修饰

目的探讨泛素连接酶Smad泛素化相关因子2(Smad ubiquitination-related factor 2,Smurf2)Nedd化修饰的机制。方法梯度过表达Nedd8检测Smuff2的蛋白水平变化,免疫共沉淀(IP)和Western印迹分析Smurf2的Nedd化修饰,GST融合蛋白沉降技术(GST-pulldown)验证相互作用,分析Smurf1 C426A基因敲入(knock in)小鼠体内Smurf2在淋巴、脾、肝和肺组织的蛋白表达水平。结果 Smurf2可发生Nedd化修饰,过表达Nedd8可导致Smurf2蛋白水平下调,Smurf1和Smurf2能相互作用,且Smurf1可使Smurf2的Nedd化修饰增强。在Smurf1 C426A基因敲入小鼠的组织细胞中Smurf2蛋白水平上调。结论 Smurf1能促进Smurf2的Nedd化修饰。

泛素蛋白连接酶及其底物在胃肠道恶性肿瘤组织中的表达及临床意义

目的探讨泛素蛋白连接酶MDM2、SKP2及相应底物p53、p27在胃肠道癌组织中的表达。方法检测30例胃肠道癌内镜下肿瘤、癌旁和正常组织活检标本上述标志物的表达情况。结果肿瘤组织MDM2、SKP2和p53高于对照；p27低于对照。MDM2与p53、SKP2与p27分别呈负相关。上述指标与患者年龄、性别、肿瘤大小、部位无关，病理分级与MDM2、SKP2和p53呈负相关，与p27呈正相关，有淋巴结转移者MDM2和SKP2更高，而p27较低。结论胃肠道恶性肿瘤的发生和转移可能与泛素蛋白连接酶作用下某些蛋白底物过度降解有关。