线粒体泛素连接酶MARCH5对缺氧/复氧损伤所致心肌细胞凋亡的影响及机制

目的探讨线粒体泛素连接酶膜相关环指蛋白5(MARCH5)对心肌细胞缺氧/复氧损伤所致心肌细胞凋亡及线粒体形态和功能的影响及其潜在机制。方法培养大鼠心肌细胞系H9C2细胞,分为4组:(1)正常(normal,N)组,予以常规培养;(2)缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)组,予以缺氧6h/复氧12h处理;(3)H/R+阴性对照(negative control,NC)腺病毒干预(H/R+NC)组,在H/R模型基础上予以阴性对照腺病毒感染处理;(4)H/R+MARCH5过表达腺病毒干预(H/R+MARCH5)组,在H/R模型基础上予以MARCH5过表达腺病毒感染处理。通过蛋白质免疫印迹法(western blot)检测MARCH5蛋白、线粒体融合蛋白(mitofusin,Mfn)1、Mfn2、动力相关蛋白1(dyna-min-related protein 1,Drp1)、线粒体分裂蛋白1(mitochondrial fission protein 1,Fis1)和低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)的表达,利用MitoTracker和MitoSOX荧光染色观察线粒体形态学和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成,分别采用流式细胞术、细胞活力(cell count-ing kit8,CCK-8)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)检测试剂盒测量细胞凋亡指数、活力和ATP水平。结果与N组细胞相比,H/R组和H/R+NC组细胞MARCH5、Mfn1和Mfn2表达减少,Drp1、Fis1和HIF-1α表达增加,同时线粒体过度分裂、ROS合成和细胞凋亡增多,ATP水平和细胞活力降低,差异有统计学意义(P均<0.05)。与H/R+NC组细胞相比,H/R+MARCH5组细胞MARCH5、Mfn1和HIF-1α表达增加,Drp1表达、线粒体过度分裂、ROS合成和细胞凋亡减少,ATP水平和细胞活力升高,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论在心肌细胞H/R过程中,MARCH5可能通过维持线粒体融合与分裂的平衡、促进HIF-1α的表达,从而抑制心肌细胞凋亡和损伤。

鱼类特有的Ring型E3泛素连接酶MARCH5A基因在刺激隐核虫感染下的表达分析

为探究大黄鱼MARCH5A的免疫作用,实验采用反转录PCR确认了该基因的c DNA序列。该序列全长1045 bp,包含1个长度为867 bp的开放阅读框,编码288个氨基酸;序列分析显示该蛋白含1个RINGv和4个跨膜结构域。进化树分析表明大黄鱼有11个MARCH家族蛋白(与哺乳动物相同),但鱼类存在多个亚型,MARCH5A为鱼类特有蛋白,其蛋白理化性质和三维结构均与MARCH5B存在一定的差异。荧光定量PCR分析显示,MARCH5A在健康大黄鱼的多个组织中均有表达,在血液和心脏中表达量最高,其次为鳃和脑,而在肾脏和皮肤中表达量最少。刺激隐核虫感染大黄鱼后,MARCH5A在皮肤中早期表达量显著上调,第2天为对照组的9.65倍,后期下调。在鳃、脾脏和头肾中的前期表达量也有所增加,后期下降。结果表明大黄鱼MARCH5A在抗刺激隐核虫免疫应答过程中可能发挥重要作用。

E3泛素连接酶FBXL5与恶性肿瘤关系的研究进展

泛素化修饰是蛋白质降解的信号，调节体内蛋白质翻译后修饰的重要途径之一，密切参与细胞周期、信号转导、DNA修复、免疫反应、一录调控等。泛素化修饰中的泛素连接酶与肿瘤的发生、发展密切相关。泛素化修饰被3种关键酶共同介导，其中E3泛素连接酶介导活泛素分子从结合酶E2转移到底物，不同的泛素连接酶靶向不同的底物蛋白，决定泛素化修饰的特异性，故E3连接酶于泛素化修饰中具有至关重要作用，已成为当前研究、探讨的热点问题之一。

miR-146b-5p靶向E3泛素蛋白连接酶促进高糖诱导的小鼠腹膜间皮细胞上皮间质转化

目的探讨miR-146b-5p与E3泛素蛋白连接酶(ZNRF3)对高糖诱导的小鼠腹膜间皮细胞上皮间质转化(EMT)进程的影响及作用机制。方法正常培养的小鼠为对照组,采用4.25%葡萄糖透析液和0.1 mg/kg的脂多糖诱导腹膜纤维化小鼠模型,收集小鼠腹膜组织,Masson染色观察腹膜组织胶原纤维变化,免疫组化法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(COL I)表达。Western blot检测腹膜组织上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、α-SMA和COL I表达。qRT-PCR检测腹膜组织中miR-146b-5p和ZNRF3表达。双荧光素酶报告基因检测验证miR-146b-5p和ZNRF3靶向关系。分离对照组小鼠腹膜间皮细胞,高糖诱导构建小鼠腹膜间皮细胞纤维化模型,将细胞分为对照组、模型组、mimic-NC组、miR-146b-5p-mimic组和miR-146b-5p-inhibitor组。Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力。Western blot检测EMT相关蛋白表达。结果与对照组小鼠比较,模型组小鼠腹膜组织增厚,胶原纤维增多,α-SMA和COL I表达增加(P<0.05),miR-146b-5p表达升高(P<0.05),E-cadherin和ZNRF3表达降低(P<0.05)。miR-146b-5p靶向负调控ZNRF3表达。细胞水平检测结果显示,与对照组比较,模型组和mimic-NC组小鼠腹膜间皮细胞迁移和侵袭细胞数增多(P<0.05),E-cadherin表达降低(P<0.05),波形蛋白(Vimentin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达升高(P<0.05)。与模型组比较,miR-146b-5p-mimic组小鼠腹膜间皮细胞变化趋势更为显著,miR-146b-5p-inhibitor组细胞EMT进程受到抑制。结论miR-146b-5p可靶向ZNRF3基因促进高糖诱导的小鼠腹膜间皮细胞EMT进程。

泛素连接酶三基序蛋白21对结直肠癌鞘氨醇激酶2的调控作用及其机制

目的探讨泛素连接酶三基序蛋白21(TRIM21)对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中鞘氨醇激酶2(SphK2)的调控作用及机制。方法将转染Flag-SphK2的PLC/RPF/5细胞分为a、b、c、d、e组,分别采用表皮生长因子刺激、葡萄糖饥饿处理、过氧化氢刺激、缺氧处理、转化生长因子-β刺激,通过质谱鉴定与SphK2互作的蛋白。将HEK-293T细胞分为f、g、h、i、j、k、l、m、n、o组,f~k组分别转染Flag-SphK2、Flag-SphK2+HA-TRIM21质粒、Flag-SphK2、Flag-SphK2+His-Ubquitin、Flag-SphK2+His-Ubquitin+1μg HA-TRIM21质粒、Flag-SphK2+His-Ubquitin+4μg HA-TRIM21质粒,l~o组分别分别转染HA-TRIM21质粒0、0.3、0.6、0.9μg,f~g组进行免疫共沉淀实验鉴定SphK2与TRIM21蛋白的相互作用情况,h~k组进行体内泛素化实验鉴定TRIM21对SphK2泛素化水平的影响,l~o组进行Western-blot实验检测TRIM21过表达对SphK2蛋白水平的影响。将His-TRIM21、GST-SphK2蛋白混合液分为p、q组,分别加入琼脂糖珠、谷胱甘肽琼脂糖珠,进行蛋白体外结合实验鉴定SphK2与TRIM21蛋白的相互作用情况。将EP管分为r、s、t三组,每组分别加入GST-SphK2+E1/E2/Ub、GST-SphK2+His-TRIM21、GST-SphK2+His-TRIM21+E1/E2/Ub蛋白,进行体外泛素化实验鉴定TRIM21对SphK2泛素化水平的影响。将RKO细胞分为u、v、w、x四组,各组分别感染LV-sgTRIM21-1、LV-sgTRIM21-2、LV-sgTRIM21-3、LV-sgControl慢病毒,采用Western-blot实验检测TRIM21敲除对RKO细胞SphK2蛋白水平及半衰期的影响,采用CCK-8实验检测TRIM21敲除对RKO细胞5-氟尿嘧啶(5-Fu)敏感性的影响。结果质谱分析、免疫共沉淀和蛋白质体外结合实验显示TRIM21与SphK2存在蛋白互作。体内、体外泛素化实验确定TRIM21介导SphK2发生多聚泛素化。在HEK-293T细胞中,TRIM21的外源过表达导致SphK2蛋白水平上调(F=196.22,P<0.05)。与x组相比,TRIM21敲除的RKO细胞系中SphK2蛋白表达水平降低、SphK2蛋白半衰期缩短、对5-Fu的敏感性增加(F=24.83~890.51,P<0.05)。结论在CRC中,TRIM21通过催化SphK2泛素化,提高了SphK2蛋白的表达水平。敲除TRIM21能提高CRC细胞对5-FU的敏感性。

MARCH5对卵巢癌细胞糖代谢的调控作用研究

目的探讨膜相关锌指蛋白5(MARCH5)在卵巢癌细胞糖代谢中的调控作用。方法将卵巢癌SKOV3细胞分为对照组(siCtrl)、MARCH5干涉组1(siMARCH5#1)与MARCH5干涉组2(siMARCH5#2),分别用葡萄糖摄取、乳酸生成、氧耗速率、ATP产生及代谢组学实验,分析下调MARCH5对卵巢癌细胞糖代谢的影响。结果与对照组SKOV3细胞相比,MARCH5干涉组1与干涉组2细胞的葡萄糖摄取[(1.00±0.06)vs(0.45±0.02)vs(0.44±0.02)]与乳酸产生[(1.00±0.05)vs(0.36±0.02)vs(0.35±0.03)]显著减少,而氧耗速率[(3.15±0.10)vs(5.73±0.14)vs(5.67±0.11)]与ATP含量[(1.00±0.04)vs(1.69±0.06)vs(1.74±0.07)]则显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05);此外,与对照组SKOV3细胞相比,MARCH5干涉组1与干涉组2细胞内糖酵解代谢物显著减少,而线粒体三羧酸循环代谢物显著增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论MARCH5促进了卵巢癌细胞糖代谢由氧化磷酸化向糖酵解的转变。

MARCH家族蛋白在免疫、生殖等方面的研究进展

膜相关RINpCH（membrane—associatedRINGCH，MARCH）家族是近年发现的一类属于E3泛素连接酶的环指结构域家族，迄今已发现的MARCH家族成员有11种，分别是MARCH1～11。MARCH家族的成员分布广泛，参与多种细胞功能，如免疫调节，蛋白质量控制和膜转运，内质网相关降解，内体蛋白质运输，线粒体动力学平衡和精子发生调控等。MARCH家族蛋白相关领域的研究正日益受到重视，

FBXL5:一种维持细胞内铁稳态的泛素连接酶

细胞内铁稳态的维持主要通过铁调节蛋白(ironregulatory protein,IRP)与几种铁代谢基因如转铁蛋白受体和铁蛋白mRNA上铁应答元件结合来实现。铁不足可增加IRP2活性和含量,而铁过载则诱导了IRP2的泛素化和蛋白降解。F-盒蛋白FBXL5是一种铁和氧依赖的E3泛素连接酶,在铁和氧存在的情况下催化IRP2的泛素化,而缺铁或缺氧则造成FBXL5自身被泛素化修饰和随后的蛋白酶体降解。FBXL5铁调节功能的发现使人们对细胞内铁稳态的理解更为清晰。

Circ_HECTD1调节miR-135a-5p/TP53INP1轴对OGD/R诱导的海马神经元损伤的影响

目的通过进行体外氧葡萄糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导海马神经元损伤,观察环状RNA含HECT结构域的E3泛素连接酶1(Circ_HECTD1)对HT22细胞增殖、凋亡的影响以及对微小RNA-135a-5p(miR-135a-5p)/肿瘤蛋白53诱导型核蛋白1(TP53INP1)轴的调控机制。方法常规培养HT22细胞,将细胞分为Con组、OGD/R组、si-NC组、si-Circ_HECTD1组、miR-NC组、miR-135a-5p组、si-Circ_HECTD1+anti-miR-NC组、si-Circ_HECTD1+anti-miR-135a-5p组。qRT-PCR法检测Circ_HECTD1、miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表达;MTT检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因实验验证Circ_HECTD1与miR-135a-5p、miR-135a-5p与TP53INP1的靶向关系;Western blot法检测Bax、Bcl-2、TP53INP1蛋白表达。结果OGD/R诱导后HT22细胞中Circ_HECTD1与TP53INP1表达上调,miR-135a-5p表达下调,细胞存活率和Bcl-2蛋白表达显著下降,凋亡率和Bax蛋白表达显著升高(均P<0.05)。沉默Circ_HECTD1表达能够显著上调OGD/R诱导的HT22细胞中miR-135a-5p表达,下调TP53INP1表达,提高细胞存活率和Bcl-2蛋白表达,降低细胞凋亡率和Bax蛋白表达(均P<0.05)。Circ_HECTD1与miR-135a-5p、miR-135a-5p与TP53INP1之间均存在靶向关系。过表达miR-135a-5p能够显著下调TP53INP1表达,提高细胞存活率、Bcl-2蛋白表达,降低细胞凋亡率、Bax蛋白表达(均P<0.05)。而抑制miR-135a-5p表达能够部分逆转沉默Circ_HECTD1对HT22细胞损伤的保护作用。结论沉默Circ_HECTD1可通过调节miR-135a-5p/TP53INP1轴,促进细胞存活,抑制细胞凋亡,保护OGD/R诱导的海马神经元损伤。

E3泛素连接酶RNF144B负调控天然免疫的分子机制

RNA病毒的RNA聚合酶缺乏校正活性,使得其突变频率较高,针对其研发疫苗难度大。RLR信号通路是抵御RNA病毒的重要天然免疫信号通路。RLR通路中两个主要成员RIG-Ⅰ与MDA5在识别病毒核酸后,激活下游信号通路的传导,引起Ⅰ型干扰素和促炎性因子的表达。近期,中国农业科学院兰州兽医研究所卢曾军研究员领导的研究团队在EMBO Reports杂志上发表了题为“RNF144B negatively regulates antiviral immunity by targeting MDA5 for autophagic degradation”的研究论文,该研究发现了一个新的RLR通路负调控分子E3泛素连接酶RNF144B,揭示了它通过催化MDA5发生K27和K33泛素化促进其通过自噬途径降解的分子机制;丰富了对RLR信号通路调控机制的认识,为病毒性疾病和自身免疫疾病的防治提供了潜在的新靶点。

FBXL5在结肠癌中的表达及临床意义

目的:通过研究E3泛素连接酶FBXL5在结肠癌组织中的表达情况,来确定和探讨其临床意义。方法:采用免疫组化方法检测20例癌旁组织及60例结肠癌组织中E3泛素连接酶FBXL5的表达情况。结果:FBXL5在结肠癌和癌旁组织中表达差异有统计学意义(P<0.0 5),其阳性率分别为8 3.3%(5 0/6 0)、25.0%(5/20)。FBXL5的表达与结肠癌的淋巴结转移(P=0.027)和临床TNM分期(P=0.013)有关。FBXL5表达与术后5年生存率明显相关(P=0.016)。Cox多因素分析显示TNM分期为结肠癌的独立预后因素。结论:FBXL5促进了结肠癌的发生、发展、侵袭及转移,希望本次研究结果能对结肠癌的治疗及发生机制提供一个方向,为后续的生物学研究及临床治疗提供一个参考。

MARCH1在免疫及肿瘤等方面的研究进展

膜相关环状蛋白家族(membrane associated RING-CH,MARCH)是一类含有环指结构域的E3泛素化连接酶,MARCH1是其成员之一。早期研究认为MARCH1主要通过泛素化主要组织相容性复合体Ⅱ和CD86影响抗原提呈过程,新近研究发现除在免疫系统中的重要作用外,MARCH1在肿瘤的发生发展中也扮演重要角色。研究报道MARCH1在卵巢癌、肝癌中作为癌基因促进肿瘤的恶性生物学行为,但在膀胱癌中MARCH1作为miR-653的下游靶点发挥抑癌作用,可见在不同肿瘤中MARCH1的作用不尽相同。此外,MARCH1参与人类免疫缺陷病毒、多器官功能障碍综合征、糖尿病等疾病的进展也有少量报道。

GATA结合蛋白5与急性心肌梗死相关性的研究进展

心血管疾病和癌症是最常见的慢性疾病,经常共存和互相依赖[1]。但目前我国心血管疾病的患病率和病死率处于上升趋势,且其病死率高于肿瘤和其他疾病,位居我国第一位,占居民疾病死亡构成比的40%以上[2]。冠状动脉疾病是影响全球人群的主要心血管疾病之一[3]。是冠状动脉壁富含胆固醇的斑块积聚所致,在炎症的作用下,冠状动脉斑块破裂或侵蚀,导致血栓形成和急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的发生[4]。

微小RNA-194-5p与cullin4A在肺结核病人中的表达及意义

目的探讨微小RNA-194-5p(miR-194-5p)与泛素连接酶cullin4A(CUL4A)在肺结核病人中的表达及其意义。方法选取2016年12月至2018年12月中国平煤神马集团职业病防治院结核病病人为研究对象,确诊为肺结核病人50例作为肺结核组,潜伏结核感染病人50例作为潜伏结核感染组,同期该院体检健康者50例作为对照组。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-194-5p、CUL4A mRNA、鸟苷酸结合蛋白5(GBP5)mRNA的表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测可溶性Tim-3(sTim-3)、可溶性Gal-9(sGal-9)水平;采用Pearson相关性分析检验肺结核病人miR-194-5p、CUL4A表达量与GBP5、sTim-3、sGal-9的相关性。结核分枝杆菌(Mtb)感染人巨噬细胞系U937,ELISA检测白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。蛋白质印迹法(Western blotting)检测Wnt/β-连环素(Wnt/β-catenin)信号通路相关蛋白T细胞因子(TCF)、糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)、β-catenin表达量。结果与对照组相比,潜伏结核感染组与肺结核组病人血清miR-194-5p、GBP5 mRNA的表达水平升高(P<0.05),其中miR-194-5p:(1.01±0.23)比(2.32±0.53)比(3.35±0.20),sTim-3、sGal-9水平升高(P<0.05),CUL4A mRNA的表达水平显著降低[(1.03±0.11)比(0.73±0.12)比(0.41±0.15),P<0.05],潜伏结核感染组与肺结核组各指标间相比差异有统计学意义(P<0.05);miR-194-5p与CUL4A呈负相关(r=-0.421,P<0.001),miR-194-5p与GBP5、sTim-3、sGal-9呈正相关(P<0.05);Mtb感染细胞后,IL-6、TNF-α的表达水平升高(P<0.05),TCF、GSK-3β、β-catenin表达量升高(P<0.05)。结论miR-194-5p在肺结核病人中表达上调,CUL4A表达下调,二者可能参与肺结核发生及发展过程。

miR-126-5p通过靶向Peli2影响糖尿病肾病肾小管上皮细胞上皮-间质转化发生

目的探讨微小RNA-126-5p(miR-126-5p)通过靶向pellino E3泛素蛋白连接酶家族成员2(Peli2)影响糖尿病肾病肾小管上皮细胞上皮-间质转化(EMT)发生的分子机制。方法本研究起止时间为2018年12月至2019年12月。体外培养人肾小管上皮细胞HK-2(美国ATCC),分别使用5 mmol/L、30 mmol/L的D-葡萄糖处理细胞48 h,分别记作对照组、模型组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测miR-126-5p、Peli2的表达水平。利用脂质体转染法分别将miR-126-5p寡核苷酸模拟物(miR-126-5p mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、Peli2小分子干扰RNA(si-Peli2)及其阴性对照(si-NC)转染至HK-2细胞,使用30 mmol/L的D-葡萄糖处理细胞48 h。Western blot检测上皮型钙黏蛋白(E-Cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、锌指蛋白(Snail)表达量;双荧光素酶报告实验验证miR-126-5p与Peli2的靶向关系。结果与对照组相比,模型组miR-126-5p[(1.00±0.10)比(0.32±0.03)]、E-Cadherin[(0.86±0.09)比(0.35±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05),Peli2[(0.42±0.04)比(1.05±0.11)]、N-Cadherin[(0.45±0.05)比(0.99±0.10)]、Vimentin[(0.32±0.03)比(0.92±0.09)]、Snail[(0.22±0.02)比(0.75±0.08)]的表达水平显著升高(P<0.05);转染miR-126-5p mimics,与转染miR-NC相比,E-Cadherin[(0.34±0.03)比(0.75±0.08)]的表达水平显著升高(P<0.05),N-Cadherin[(1.02±0.11)比(0.53±0.05)]、Vimentin[(0.95±0.10)比(0.48±0.05)]、Snail[(0.72±0.07)比(0.36±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05);转染si-Peli2后,与转染si-NC相比,E-Cadherin[(0.24±0.03)比(0.70±0.07)]的表达水平显著升高(P<0.05),N-Cadherin[(1.05±0.12)比(0.50±0.05)]、Vimentin[(0.96±0.10)比(0.38±0.04)]、Snail[(0.74±0.07)比(0.40±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05);miR-126-5p能够特异性结合Peli2,Peli2是miR-126-5p的靶基因;Peli2过表达后可明显逆转miR-126-5p过表达对高糖诱导的HK-2细胞EMT的影响。结论miR-126-5p通过靶向Peli2抑制糖尿病肾病肾小管上皮细胞EMT发生。

MARCH2简述

MARCH(membrane-associatedRING-CHfingerprotein)家族是在21世纪初发现的一类E3泛素连接酶,有11个家族成员,在生物体内通过对底物蛋白进行泛素化修饰从而发挥多种调控作用。膜相关RING-CH蛋白2(membrane-associatedRING-CHproteinⅡ),简称MARCH2,常见的靶点有转铁蛋白受体(transferrinreceptor,TfR)、突触融合蛋白6(syntaxin 6,STX-6)、CD86(B7-2)、人DLG1(discslargetumoursuppressor)和囊性纤维跨膜传导调节因子(cysticfibrosistransmembrane conductanceregulator,CFTR)以及β2肾上腺素能受体(β2-adrenergicreceptors,β2-AR),在病毒免疫逃避、肿瘤发生及激动剂脱敏等方面发挥着作用。其主要通过泛素化修饰在哺乳动物的蛋白修饰及泛素化降解过程,发挥着举足轻重的作用,尤其是调控细胞内囊泡运输的蛋白及表面受体。但目前对MARCH2的功能研究仍有许多空白之处尚待填补。本文就MARCH2的起源、结构及功能进行阐述,为后续基础及临床研究提供一定的依据。

miR-142-5p通过靶向作用WWP1对前列腺癌细胞PC-3生物学行为的影响

目的探究miR-142-5p与泛素蛋白连接酶1(WWP1)的靶向性及miR-142-5p靶向作用WWP1对前列腺癌细胞PC-3生物学行为的影响。方法采用RT-PCR检测前列腺癌组织和癌旁组织中miR-142-5p与WWP1 mRNA的表达情况;采用荧光素实验验证miR-142-5p与WWP1的靶向关系。体外培养前列腺癌细胞PC-3细胞并分为NC组、miR-142-5p组、WWP1组和miR-142-5p+WWP1组。各组细胞采用对应模拟物转染后,使用Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,使用划痕实验检测细胞迁移能力;使用蛋白质印迹实验检测侵袭迁移相关蛋白(E-cadherin,N-cadherin和Vimentin)相对表达水平;采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果癌组织中miR-142-5p相对表达水平显著低于癌旁组织(0.68±0.16 vs 1.88±0.22;t=19.727;P<0.05);癌组织中WWP1 mRNA相对表达水平显著高于癌旁组织(2.07±0.24 vs 0.24±0.13;t=32.027;P<0.05)。miR-142-5p野生纯合子和WWP1野生纯合子混合组荧光霉素活性显著低于其他各组(P<0.05),荧光霉素验证miR-142-5p和WWP1存在结合位点。相比NC组,miR-142-5p组miR-142-5p相对表达水平显著升高(P<0.05),WWP1水平显著降低(P<0.05);相比NC组,WWP1组miR-142-5p相对表达水平显著降低(P<0.05),WWP1水平显著升高(P<0.05)。相比WWP1组,miR-142-5p+WWP1组miR-142-5p相对表达水平显著升高(P<0.05),WWP1 mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05)。相比NC组,miR-142-5p组单位面积内侵袭细胞数目、划痕愈合率、N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05),细胞凋亡率和E-cadherin蛋白相对表达水平显著升高(P<0.05);相比NC组,WWP1组单位面积内侵袭细胞数目、划痕愈合率、N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达水平显著升高(P<0.05),细胞凋亡率和E-cadherin蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05);相比WWP1组,miR-142-5p+WWP1组单位面积内侵袭细胞数目、划痕愈合率、N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05),细胞凋亡率和E-cadherin蛋白相对表达水平显著升高(P<0.05)。结论miR-142-5p可以靶向结合WWP1降低前列腺癌组织中WWP1表达,miR-142-5p靶向作用WWP1可抑制体外培养的前列腺癌细胞PC-3的侵袭和迁移,同时促进其凋亡。

KLHL5参与蛋白质泛素化修饰的生物学意义

泛素化是一种重要的蛋白修饰方式,通过将泛素与靶蛋白共价结合,调节靶蛋白的功能和稳定性,在分子和细胞水平上调节免疫系统。最近的研究发现,肌动蛋白结合蛋白KLHL5参与了泛素化修饰的过程。KLHL5通过连接E3泛素连接酶和泛素的协同作用,调节多种细胞生理过程,包括蛋白酶体降解、转录调节、蛋白-蛋白质相互作用、内吞作用、自噬、DNA修复和细胞周期调节等。它对免疫系统的调节以及相关疾病的发生发展具有重要影响。文章回顾总结了KLHL5参与的泛素化过程对蛋白的修饰作用。

干扰Cul5对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究泛素连接酶库伦-5(Cullin5,Cul5)对牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响,本实验采用牛肌卫星细胞进行体外实验模拟牛体内的成肌分化过程,根据基因的表达序列设计Cul5的小干扰RNA(si-RNA),通过实时定量PCR(qRT-PCR)蛋白质印迹(Western Blot)技术筛选出干扰效果最好的si-RNA转染细胞。成功干扰Cul5后,在转录、蛋白、细胞水平上分别采用qRT-PCR、Western Blot和EdU细胞增殖实验,检测细胞增殖及分化标志因子的表达水平。试验发现,干扰Cul5后,在蛋白水平上Pax7呈显著上调趋势,MyHC呈显著下调趋势,EdU染色阳性细胞率与对照组相比呈显著上调趋势。细胞光镜图下,实验组肌管的数量明显少于对照组。研究结果可见:敲低Cul5的表达能够促进牛肌卫星细胞的增殖,并抑制其分化进程。

乳腺癌组织中miR-9-5p、UBE3C的表达及临床意义

目的:分析乳腺癌组织中微小RNA-9-5p(miR-9-5p)、泛素连接酶E3C(UBE3C)的表达水平,并探讨其与预后的关系。方法:收集2015年1月—2016年1月行手术治疗的50例乳腺癌患者的临床资料及乳腺癌组织和对应的癌旁正常组织标本。采用实时荧光定量PCR法检测miR-9-5p表达水平;Ualcan数据库分析乳腺癌组织UBE3C基因表达水平;免疫组织化学法检测乳腺癌组织中UBE3C蛋白表达;分析乳腺癌组织中miR-9-5p、UBE3C表达水平与临床病理特征的关系;随访5年,分析miR-9-5p、UBE3C水平与乳腺癌患者5年累积生存率的关系。结果:检索Ualcan数据库发现乳腺癌组织中UBE3C基因表达水平高于癌旁组织(P<0.05);与癌旁组织相比,乳腺癌组织中miR-9-5p、UBE3C表达水平均升高(P<0.05);miR-9-5p、UBE3C表达水平均与淋巴结转移、TNM分期相关(P<0.05);miR-9-5p高表达患者5年累积生存率(31.80%)低于miR-9-5p低表达患者(78.60%),差异有统计学意义(χ^(2)=13.127,P<0.001);UBE3C高表达患者5年累积生存率(36.40%)低于UBE3C低表达患者(64.10%),差异有统计学意义(χ^(2)=5.636,P=0.018)。结论:miR-9-5p、UBE3C在乳腺癌组织中高表达,与乳腺癌患者部分临床病理特征有关,可影响患者预后。