水稻泛素连接酶D3与抗病相关蛋白VOZ2的互作分析

多蘖矮秆基因dwarf-3(D3)是水稻独脚金内酯信号转导过程中的重要节点基因,拟南芥中的MAX2基因与D3同源,且MAX2参与拟南芥的抗病防卫反应。本研究以水稻泛素连接酶D3为诱饵进行酵母双杂筛库,发现水稻抗病相关蛋白维管植物单锌指蛋白VOZ2与D3存在潜在的相互作用。通过酵母双杂交试验证实,D3与VOZ2存在互作。通过荧光定量PCR证实,接种水稻白叶枯病菌后,VOZ2基因在转录水平上的表达受到显著诱导。利用水稻原生质体开展的亚细胞共定位实验发现,D3与VOZ2共定位于细胞核。双分子荧光互补实验发现,D3与VOZ2在烟草叶肉细胞的细胞核和细胞质均产生较强的荧光,进一步证实了D3与VOZ2的相互作用。研究结果为进一步探究D3和VOZ2在水稻抗病防卫反应中的功能与分子机理奠定了基础。

泛素连接酶MuRF2通过抑制线粒体自噬减轻心肌细胞缺氧损伤

目的探讨泛素连接酶肌肉环指状蛋白2(muscle ring finger protein 2,MuRF2)对缺氧心肌细胞活力和自噬的调控作用。方法构建大鼠源MuRF2基因过表达和敲减慢病毒载体,分别感染大鼠心肌细胞H9C2。将H9C2细胞分为阴性对照组(NC)、阳性对照组[MuRF2过表达空载体组(LV-Vector)、MuRF2敲减空载体组(LV-RNAi-Vector)]、Mu RF2过表达组(LV-MuRF2)和MuRF2敲减组(LV-RNAi-MuRF2),缺氧培养(5%CO_(2)、1%O_(2)、94%N_(2))后,采用CCK-8法和ELISA法检测心肌细胞损伤水平,利用透射电子显微镜检测心肌细胞超微结构和自噬水平变化,采用Western blot测定自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和P62的表达水平。结果与对照组相比,缺氧组心肌细胞间隙增大、细胞皱缩、多见漂浮的死亡细胞和细胞碎片,心肌细胞活力下降、肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)含量增加(P均<0.05);电子显微镜下可观察到部分线粒体发生肿胀,并存在嵴断裂、嵴溶解现象,自噬小体散在胞质内;缺氧组LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高,P62蛋白表达水平降低(P均<0.05)。缺氧培养后,与NC组和LV-Vector组相比,LV-MuRF2组细胞活力增加,偶见自噬小体,LC3-Ⅱ蛋白表达水平降低、P62蛋白表达水平增高(P均<0.05);与NC组和LV-RNAi-Vector组相比,LV-RNAi-MuRF2组细胞活力降低,可见大量自噬小体,LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高、P62蛋白表达水平降低(P均<0.05)。结论泛素连接酶MuRF2可减轻缺氧所致的心肌细胞损伤,其机制可能与抑制心肌细胞线粒体自噬有关。

肾透明细胞癌组织中泛素连接酶Pirh2蛋白的表达及其临床意义

目的探讨肾透明细胞癌组织中泛素连接酶Pirh2蛋白（p53-induced RING—H2 protein，Pith2）的表达及与临床病理特征和预后的关系。方法肾透明细胞癌标本92例，G1 29例、G2 36例、G3 24例、G4 3例，T1 55例、T2 16例、T3 20例、T4 1例；正常肾组织标本20例作为对照组。采用免疫组织化学方法检测两组标本组织中Pirh2蛋白的表达，并结合临床资料进行分析。结果正常肾组织中Pith2蛋白表达率为20．0％（4／20），肿瘤组织为52．2％（48／92），且随组织病理分级和分期增加，Pirh2蛋白表达量逐渐增高。Pirh2蛋自在G1、G2、G3、G4组织中的高表达阳性率分别为24．1％、30．6％、75．0％和66．7％，T1、T2、T3、T4期肿瘤组织中高表达阳性率分别为25．5％、50．0％、75．O％和100．0％，分级问分期问差异有统计学意义（P=0．001）。随访7～70个月，平均42个月，复发10例，复发组与未复发组中Pirh2蛋白高表达阳性率分别为80．0％和36．6％，差异有统计学意义（P=0．022）。Kaplan．Meier曲线显示，Pith2蛋白高表达组与低表达组患者术后总生存率（71．1％与94．4％）和无复发生存率（78．9％与96．3％）比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论Pirh2蛋白高表达与肾透明细胞癌的恶性程度及预后相关，Pirh2与肾透明细胞癌的发生和发展存在相关性。

泛素E3连接酶膜相关锌指蛋白2高表达与胃癌临床分期、侵袭性及预后的相关性

目的研究泛素E3连接酶膜相关锌指蛋白2(MARCH2)高表达与胃癌分期、侵袭及预后之间的关系。方法将96例行胃癌根治术的胃癌患者纳为研究对象,免疫组织化学法检测患者胃癌组织及癌旁组织内MARCH2表达情况,分析MARCH2阳性表达与患者临床病理特征之间的关系。术后随访5~47个月,采用Kaplan-Meier法分析胃癌组织内MARCH2表达情况与患者生存时间的关系。结果胃癌组织内MARCH2阳性表达率高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。胃癌组织内MARCH2阳性表达与胃癌浸润深度以及淋巴结转移有关(P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期以及分化程度无关(P>0.05)。将胃癌组织内MARCH2中、强阳性表达者纳为MARCH2强阳性表达组,其余患者纳为对照组,随访5~47个月,平均(34.51±6.16)个月,绘制生存曲线发现,强阳性组患者生存时间短于对照组,差异具有统计学意义(Rank=8.923,P=0.003)。结论胃癌组织内MARCH2阳性表达率明显上升,且MARCH2阳性表达与肿瘤浸润深度及淋巴结转移间存在密切联系,MARCH2高表达者预后生存时间更短,提示MARCH2可能参与胃癌的发生及发展。

泛素E3连接酶CHIP介导RCC2的泛素化及降解

目的 本课题组前期构建了一种正交泛素传递方法,并发现染色体浓缩调节蛋白2(RCC2)是泛素连接酶CHIP的潜在底物。本实验旨在验证CHIP是否能介导RCC2的泛素化及降解,以期通过CHIP来泛素化调控RCC2的表达和功能。方法 首先构建CHIP及其突变体质粒,验证CHIP与RCC2是否有相互作用;然后构建pLVX-RCC2-FLAG重组质粒并转染进CHIP敲减细胞株(shCHIP)、HEK293细胞株、CHIP过表达细胞株(OE CHIP),通过免疫共沉淀下拉富集RCC2-FLAG并检测其泛素化水平;接下来在HEK293细胞中转染不同量的CHIP,以及设置CHX chase蛋白稳定性实验,检测RCC2的蛋白水平变化;最后利用泛素突变体K48R-Ub及K11R-Ub进行CHIP介导RCC2上形成泛素链的实验检测。结果 在HEK293细胞中,CHIP能够介导RCC2的泛素化,并在RCC2上形成K48和K11多聚泛素链,促进其通过蛋白酶体发生降解。结论 泛素连接酶CHIP能够介导RCC2的泛素化及降解,为实现通过CHIP来泛素化调控RCC2提供了理论基础。

泛素连接酶E4B介导PM20D2、PABPC1和TACO1蛋白质的泛素化验证

泛素连接酶E4B通过U-box基序可将经泛素活化酶(Ubiquitin-activating enzyme, E1)和泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme, E2)传递的泛素(Ubiquitin, UB)标记至底物蛋白质。探究3个蛋白质:金属蛋白酶M20家族蛋白质2(Peptidase M20 domain-containing protein 2,PM20D2)、多腺苷酸结合蛋白质1(Polyadenylate-binding protein 1,PABPC1)、细胞色素C氧化酶Ⅰ翻译激活剂(Translational activator of cytochrome C oxidase Ⅰ,TACO1)是否可被E4B介导泛素化。从HEK293细胞中提取总RNA,反转录为cDNA,以其为模板调取底物基因并构建重组质粒,利用大肠杆菌表达系统表达并纯化泛素化过程所需的各个相关蛋白质,通过蛋白质体外泛素化实验,对3个蛋白质进行泛素化验证。结果表明3个蛋白质均可以在蛋白质水平被E4B泛素化,证明3个蛋白质都是E4B的底物,为进一步在细胞中研究其泛素化的机理奠定基础。

E3泛素连接酶1对SOX2蛋白稳定性的影响

目的探讨WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1(WWP1)和E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)对3种转录因子[八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区Y-box蛋白2(SOX2)和NANOG蛋白]水平的影响。方法通过质粒转染,在HEK 293FT细胞中分别共表达OCT4、SOX2、NANOG和WWP1或WWP2。通过免疫印迹法检测WWP1或WWP2过表达对OCT4、SOX2、NANOG蛋白水平的影响。通过GST pull-down实验和免疫共沉淀实验分析WWP1与SOX2蛋白间的相互作用;运用体外蛋白质泛素化修饰实验证明WWP1是否为SOX2的特异E3泛素连接酶。结果在WWP1与OCT4、WWP1与SOX2及WWP2与OCT4共表达体系中,WWP1或WWP2均呈剂量依赖性地下调对应的共表达蛋白OCT4或SOX2水平,且以WWP1与SOX2共表达体系中SOX2蛋白的表达下调最为明显。在其他共表达体系中,WWP1或WWP2对对应的共表达蛋白均无明显的下调作用。溶酶体抑制剂氯喹可部分阻止SOX2蛋白水平的降低。放线菌酮(CHX)处理24 h后,WWP1与SOX2共表达体系中的SOX2蛋白水平的下降速度快于单独过表达SOX2(P<0.05)。WWP1可以通过与SOX2蛋白的直接相互作用催化SOX2蛋白的泛素化修饰。结论WWP1是SOX2蛋白新的E3泛素连接酶,可促进SOX2蛋白经泛素-溶酶体途径降解,进而下调SOX2蛋白的表达。

泛素连接酶RING2对苯并[a]芘染毒人支气管上皮细胞周期和P53蛋白表达的影响

目的:探讨泛素连接酶RING2对苯并[a]芘(Ba P)染毒人支气管上皮16HBE细胞周期和P53蛋白表达的影响。方法:以16HBE未处理组为阴性对照组,二甲基亚砜(DMSO)组为溶剂对照组,MOCK组为序列对照组。在使用RNA干扰技术降低16HBE细胞泛素连接酶RING2基因表达前后,分别采用不同浓度Ba P(1、2、4、8、16、32μmol/L)染毒24 h;或16μmol/L Ba P染毒不同时间(1、2、4、8、12、24 h)。用流式细胞术检测干扰前后两组细胞周期分布情况,用Western-blot法检测干扰前后两组细胞P53蛋白表达水平。结果:流式细胞术检测结果显示,与阴性对照组比较,16HBE细胞染毒后各浓度和各时点组S期细胞所占的比例均增加(P<0.05),而16HBE(si RNA-RING2)各浓度和各时点组S期细胞所占的比例均下降(P<0.05)。协方差分析显示分组因素(是否进行RNAi)和染毒浓度都对S期细胞比例有影响(P均<0.01),16HBE(si RNA-RING2)细胞组的修正均数(17.09%)比16HBE细胞组(31.55%)明显降低(P<0.01)。分组因素和染毒时间都对S期细胞比例有影响(P均<0.01),16HBE(si RNA-RING2)细胞组的修正均数(13.07%)比16HBE细胞组(28.04%)明显下降(P<0.01)。Western-blot结果显示,与阴性对照组比较,16HBE细胞染毒后各浓度和各时点组P53的表达水平均增加(P<0.05),而16HBE(si RNA-RING2)细胞除16μmol/L染毒8 h组外,其余各组P53的表达水平均降低(P<0.05)。协方差分析显示分组因素和染毒浓度都对P53的表达水平有影响,P值分别为0.026和0.028。16HBE(si RNA-RING2)细胞组的修正均数(0.989)比16HBE细胞组(1.375)明显下降(P<0.05);分组因素和染毒时间都对P53的表达水平有影响,P值分别为0.007和0.035。16HBE(si RNA-RING2)细胞组的修正均数(0.857)比16HBE细胞组(1.541)明显下降(P<0.05)。结论:RING2参与的组蛋白泛素化修饰可能通过影响P53表达和细胞周期S期的变化来发挥对DNA损伤修复的调控。

E3泛素连接酶WWP2通过蛋白酶体途径调控p21的稳定性

目的 探讨含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2 (WWP2)调控p21稳定性的潜在作用机制。方法 通过免疫共沉淀及Western blotting检测HEK 293T细胞中WWP2与p21的结合情况。用蛋白酶体抑制剂(MG132)和放线菌酮(CHX)处理过表达或敲减WWP2 HEK 293T细胞0、4、8 h,通过Western blotting检测p21的表达情况。结果 WWP2与p21间存在结合。过表达WWP2的293T细胞中,p21的表达水平明显降低,且随WWP2表达量增加逐渐降低。敲减WWP2的293T细胞中,p21表达水平增加。随着CHX作用时间延长,对照组和实验组的p21表达水平均逐渐下降。过表达组p21半衰期较对照组缩短;敲减组p21半衰期较对照组延长。随着MG132作用时间延长,对照组和实验组p21表达水平均逐渐上升。空载组较过表达组、敲减组较对照组p21积累均更显著。结论 E3泛素连接酶WWP2可与p21结合,并通过蛋白酶体途径降解p21。

泛素蛋白连接酶复合体KPC的研究进展

泛素蛋白酶体途径是真核生物体内最重要的蛋白质降解途径之一,其中,目标蛋白的泛素化过程涉及泛素激活酶、泛素结合酶和泛素蛋白连接酶(E3)。目标蛋白识别中起关键作用的是E3,Kip1泛素-促进复合体(KPC)是一种E3复合体,由KPC1和KPC2组成,KPC1在C端含有一个环指结构域作为催化亚基,是E3不可缺少的组成部分,KPC2含有一个类泛素结构域和两个泛素相关结构域。KPC广泛存在于真核生物中,在神经系统疾病、血液系统疾病、肿瘤疾病等方面起着重要的调控作用。

泛素连接酶E4B介导POLDIP2的泛素化及其降解

目的旨在细胞外和HEK293细胞中鉴定聚合酶δ相互作用蛋白2(POLDIP2)是否为泛素连接酶E4B的底物,并探究E4B能否介导POLDIP2经由26S蛋白酶体降解。方法利用BL21表达并纯化POLDIP2蛋白,设置体外E1-E2-E3泛素传递反应,通过western blot检测POLDIP2的泛素化;同时,构建pcDNA-Flag-POLDIP2重组质粒并转染进HEK293细胞、E4B敲减稳转株(shE4B)、E4B过表达细胞株(E4B OE)中,通过免疫共沉淀检测E4B表达量的变化是否影响POLDIP2的泛素化水平;其次,进一步通过CHX Chase实验,以及在HEK293细胞中转染依次增量的pLVX-E4B质粒,通过western blot检测POLDIP2蛋白水平的变化。结论胞外泛素化反应和胞内泛素化鉴定均证实泛素连接酶E4B可以将POLDIP2泛素化,并且能够介导其通过26S蛋白酶体进行降解。

川续断皂苷B抑制线粒体E3泛素连接酶1减轻缺血性中风大鼠脑损伤

目的探讨川续断皂苷B对缺血性脑卒中的作用及机制。方法SD大鼠和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞分别给予左脑缺血2 h、再灌注24 h和低氧8 h、复氧24 h的处理,在动物水平和离体水平建立缺血性脑卒中模型并给予不同剂量的川续断皂苷B。通过神经功能学评分、TTC染色、TUNEL染色检测大鼠脑损伤以及运用MTS法、LDH细胞毒性释放实验、流式细胞术等手段检测PC12细胞损伤,并运用Western印迹法对相关蛋白水平进行检测。运用MOE分子对接软件对川续断皂苷B和线粒体E3泛素连接酶1(Mul1)进行分子相互作用预测。结果与假手术组相比,模型组大鼠发生了严重脑损伤(神经功能学评分升高、脑梗死灶出现、TUNEL阳性细胞增多,胱天蛋白酶3活性增强、ATP产量减少),同时Mul1和动力相关蛋白1(Drp1)水平升高,mitofusin2(Mfn2)蛋白水平降低。川续断皂苷B能够减弱脑损伤并逆转Mul1,Drp1和Mfn2的蛋白水平改变。离体水平结果一致,与对照组相比,低氧处理的PC12细胞出现了细胞损伤(细胞PI阳性率从5%左右增加至35%左右、胱天蛋白酶3活性增强、LDH释放率增加)和线粒体功能下降(线粒体膜电位ΔΨm和ATP产量下降,ROS产量和线粒体分裂增加),同时Mul1和Drp1表达上调,Mfn2蛋白水平降低,以上现象能被川续断皂苷B抑制。MOE分子对接结果显示,川续断皂苷B可能和Mul1294位Asp、303位和320位Val和318位Gly存在相互作用。结论川续断皂苷B能够通过抑制Mul1改善线粒体功能保护大鼠脑组织免于缺血性损伤。

HECW2基因与肿瘤的研究进展

含HECT,C2和WW域E3泛素蛋白连接酶2(HECW2)基因通过调节蛋白质的泛素化和降解过程参与细胞周期调控、信号转导以及细胞死亡等关键的生物学过程。既往有关HECW2基因的研究多聚焦于神经发育障碍与智力障碍等非肿瘤方面,而关于其在肿瘤发生发展中的作用机制的报道较少。近年研究认为HECW2基因在多种肿瘤类型中异常表达,并在肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭过程中发挥重要功能,可影响肿瘤的生物学行为,这为后续探索肿瘤的分子机制提供了新的视角,为肿瘤的个性化靶向治疗奠定了前期基础。

siah E3泛素蛋白连接酶2对胰腺癌细胞增殖的影响及机制

目的检测siah E3泛素蛋白连接酶2(SIAH2)对胰腺癌细胞增殖的影响及探讨其机制。方法应用生物信息学分析胰腺癌与SIAH2的临床相关性。用免疫组织化学(IHC)染色检测癌组织与癌旁组织中SIAH2的表达量。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)及蛋白质印迹法(Western blot)检测胰腺癌细胞和正常胰腺导管细胞中基因的表达。用SIAH2的小干扰RNA(siRNA)感染PANC-1及SW1990胰腺癌细胞;5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EDU)和细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测SIAH2对胰腺癌细胞增殖的影响。组间比较采用t检验。结果生物信息学及IHC实验显示SIAH2在胰腺癌中表达升高(P<0.05)。SIAH2的表达与患者的总生存期和无病生存期呈负相关,与肿瘤分级、分期和T分期相关(P<0.05)。RT-qPCR及Western blot结果显示,正常胰腺导管细胞(HPDE)中SIAH2 mRNA及蛋白表达量低于胰腺癌细胞(BXPC-1、PANC-1、SW1990、MIA-PaCA-2、ASPC-1)(RT-qPCR:0.997±0.047比2.533±0.404比3.000±0.458比2.800±0.400比2.267±0.351比1.667±0.153,t=6.489、7.247、7.570、5.536、10.220,P<0.05;Western blot:1.000±0.027比1.740±0.187比2.213±0.474比2.242±0.328比1.734±0.209比1.898±0.189,t=7.697、4.672、7.139、6.219、7.925,P<0.05)。敲低SIAH2后胰腺癌细胞增殖能力降低。Western blot实验结果发现,siRNA组SMO、GLI1、PCNA表达低于NC组[SMO:PANC-1(0.999±0.019比0.473±0.010比0.412±0.017;t=92.380、34.670);SW1990(1.000±0.054比0.476±0.023比0.453±0.017;t=21.740、14.010);GLI1:PANC-1(0.999±0.014比0.484±0.040比0.514±0.039;t=2.817、2.790);SW1990(1.004±0.030比0.443±0.024比0.476±0.018,t=24.860、50.780);PCNA:PANC-1(0.999±0.007比0.390±0.030比0.390±0.079,t=24.240、13.790);SW1990(1.001±0.016比0.534±0.050比0.450±0.026,t=14.080、50.540,P<0.05)]。在回复实验中,敲低后的SIAH2加入SAG后,细胞增殖能力恢复,并且Western blot实验结果发现,si-SIAH2#1+SAG组SMO、GLI1、PCNA表达高于si-SIAH2#1组[SMO:PANC-1(0.974±0.018比0.466±0.012,t=36.200);SW1990(0.965±0.026比0.410±0.018,t=6.880);GLI1:PANC-1(1.005±0.023比0.464±0.042;t=20.850);SW1990(1.002±0.021比0.504±0.018,t=21.980);PCNA:PANC-1(0.956±0.036比0.501±0.015,t=16.580);SW1990(0.989±0.066比0.535±0.031,t=8.620,P<0.05)]。si-SIAH2#2+SAG组SMO、GLI1、PCNA表达高于si-SIAH2#2组[SMO:PANC-1(1.002±0.043比0.410±0.018,t=18.200);SW1990(1.000±0.015比0.415±0.023,t=49.400);GLI1:PANC-1(0.999±0.077比0.458±0.043,t=15.610);SW1990(0.974±0.030比0.527±0.037,t=26.350);PCNA:PANC-1(0.974±0.014比0.512±0.021,t=47.470);SW1990(1.000±0.035比0.535±0.053,t=14.320,P<0.05)]。结论SIAH2在胰腺癌组织及细胞中高表达及表达量与患者预后负相关,且SIAH2通过Hedgehog通路促进胰腺癌细胞增殖。

泛素连接酶PIRH2和p53蛋白在胃癌中的表达关系及意义

目的研究PIRH2和p53蛋白在胃癌组织中的表达水平及其与胃癌生物学行为和预后的关系。方法应用免疫组化方法检测84例胃癌组织中PIRH2和p53蛋白的表达水平。结果 PIRH2和p53蛋白表达之间呈显著负相关(P<0.05)。PIRH2和p53蛋白表达水平与胃癌淋巴结转移、远处转移和pTNM分期均密切相关(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、组织类型、浸润深度无显著相关(P>0.05)。PIRH2+/p53-组的胃癌患者3年生存率显著低于其他组(PIRH2-/p53-,PIRH2+/p53+,PIRH2-/p53+)(P=0.002,0.013,0.005)。且多因素生存分析显示,PIRH2和p53蛋白水平是独立的预后因素(P=0.003)。结论 PIRH2和p53蛋白表达与胃癌淋巴结转移及预后有关;PIRH2蛋白表达阳性和p53蛋白表达阴性提示胃癌不良预后。

泛素连接酶Pirh2与恶性肿瘤相关性的研究进展

泛素连接酶Pirh2(p53-induced RING-H2 protein)是一种具有E3连接酶活性的新蛋白,能促进p53发生泛素化而降解,从而使p53抑制肿瘤生长的功能减弱或消失,导致肿瘤发生和进一步恶化。近年来研究发现,多种恶性肿瘤中Pirh2蛋白的表达量有明显变化,这提示Pirh2在恶性肿瘤的发生、发展中可能具有重要的作用;Pirh2可能作为一个癌基因,在肿瘤发生过程中调节一些信号转导通路。因此,推测Pirh2可作为肿瘤基因治疗的一个潜在靶点。本文就Pirh2与恶性肿瘤相关性的最新研究进展作一简要综述。

CBL通过泛素化降解NCK2抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭

目的阐明Casitas B系淋巴瘤(CBL)蛋白对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响并探讨其作用机制。方法乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF7常规培养,实验分为NC组、过表达CBL组和siNC组、siCBL组,采用克隆形成法和细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、伤口愈合实验、Transwell实验检测过表达(沉默)CBL对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;流式细胞术和Western blot验证CBL对乳腺癌细胞周期进程、细胞周期标志物和上皮-间充质转化(EMT)的影响;罗丹明标记的鬼笔环肽染色细胞骨架观察CBL对细胞丝状伪足数量的影响。采用IP-质谱法筛选CBL的相互作用蛋白并确定NCK2为研究对象。实验分为CBL组、NCK2组、CBL+NCK2组,通过免疫共沉淀(IP)和免疫荧光共定位实验验证CBL与NCK2蛋白互作情况。通过环己酰亚胺追踪实验和泛素化实验检测CBL对NCK2蛋白稳定性和泛素化的影响。采用CCK-8和Transwell实验检测NCK2对CBL介导的乳腺癌细胞增殖及迁移能力的影响。结果过表达CBL组的细胞增殖、迁移、侵袭能力显著降低(P<0.05);沉默CBL组的细胞增殖、迁移、侵袭能力显著增加(P<0.01)。沉默CBL促进MCF7细胞周期G1/S转换(P<0.05)。过表达CBL下调乳腺癌细胞周期相关蛋白CDK2/4(P<0.01)、Cyclin A2/B1/D1/D3/E2(P<0.05)、EMT相关蛋白Snail、N-Cadherin、Claudin-1(P<0.05),同时上调E-Cadherin(P<0.05);沉默CBL上调乳腺癌细胞周期相关蛋白CDK2/4/6(P<0.05)、Cyclin A2/B1/D1/D3/E2(P<0.05),EMT相关蛋白Snail、Vimentin、Claudin-1(P<0.05),同时下调E-Cadherin(P<0.05)。过表达CBL使乳腺癌细胞系MDA-MB-231中丝状伪足数量减少;沉默CBL使乳腺癌细胞系MCF7中丝状伪足数量增加。NCK2与CBL相互作用。过表达CBL抑制NCK2蛋白稳定性(P<0.05),并促进其泛素降解(P<0.01)。过表达NCK2能够逆转CBL介导的乳腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用(P<0.01)。结论CBL可通过泛素化降解NCK2抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。

MuRF2、PPAR γ1和Ub重组质粒的构建及鉴定

目的 构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ亚型1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma isoform 1,PPAR γ1)、泛素连接酶肌肉环指状蛋白2(ubiquitin ligase muscle ring finger protein 2,MuRF2)和泛素(ubiquitin,Ub)的重组质粒并进行鉴定。方法 根据MuRF2、PPAR γ1和Ub的cDNA序列及GV146和GV417载体质粒上的多克隆位点设计目的基因克隆引物。XhoI/EcoRI内切酶分别双酶切PPAR γ1目的DNA与GV146载体;NheI/BamHI内切酶分别双酶切MuRF2和Ub目的 DNA与GV417载体。用连接酶连接双酶切后的目的 DNA和载体,导入大肠杆菌经筛选获得重组质粒。PCR鉴定重组克隆后进行DNA测序。转染HEK 293T细胞后,于荧光显微镜下观察转染效率;免疫共沉淀实验后用Western blot检测蛋白的表达及蛋白质相互作用。结果 以合成的PPAR γ1、Ub、MuRF2的引物分别对PPAR γ1、Ub和MuRF2的菌落进行PCR扩增,产物大小分别为943、451和1 154 bp,与预期结果一致。测序结果与目的基因序列进行比对分析,证实成功构建出PPAR γ1、Ub和MuRF2的重组质粒。在HEK 293T细胞中共转染His-MuRF2、HA-Ub、PPAR γ1重组质粒,荧光显微镜观察结果提示重组质粒成功转染。免疫共沉淀试验后用Western blot检测可见PPAR γ1、MuRF2和Ub蛋白的有效表达,且验证了MuRF2介导PPAR γ1发生泛素化修饰反应。结论成功构建PPAR γ1、MuRF2和Ub的重组质粒,且三种质粒在HEK 293T细胞中有效表达,验证了MuRF2介导PPAR γ1发生泛素化修饰反应。

一种关键的生物钟调控蛋白CRY2与肿瘤发生之间可能有着密切关联

科学家发现,一种关键的生物钟调控蛋白CRY2与肿瘤发生之间可能有着密切关联,并提示,生物钟的打乱可能使得原癌蛋白c-MYC的水平处于失控状态。

泛素连接酶Pirh2在肿瘤中的研究进展

泛素连接酶Pirh2是体内E3泛素连接酶的一种，可通过泛素一蛋白酶体途径介导p53降解，抑制p53的生物学功能。近来研究表明Pirh2在人体多种肿瘤细胞中呈过度表达，提示其可能参与肿瘤发生和发展过程，将来可能作为肿瘤基因治疗的一个潜在靶点。