脊髓性肌萎缩症中运动神经元生存蛋白缺失抑制p53泛素化降解致其积累的研究

目的探究脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)中p53积累的分子机制。方法构建运动神经元生存基因(Survival motor neuron,Smn)敲低的稳转小鼠运动神经元细胞系NSC34,采用蛋白质印迹和荧光定量PCR检测蛋白和基因的变化;用蛋白合成抑制剂放线菌酮(Cycloheximide,CHX)抑制蛋白合成,蛋白质印迹检测p53蛋白降解情况,采用免疫共沉淀检测p53与MDM2结合情况;采用免疫荧光检测小鼠脊髓组织运动神经元数量,运用流式细胞仪分析细胞周期的分布。结果在Smn敲低的NSC34细胞中,p53蛋白水平显著增加,但是其基因水平未发生明显变化;当蛋白合成被抑制后,SMN缺失会抑制p53蛋白降解,p53积累后会调控下游MDM2表达显著增加,但是其与p53结合却显著减少;p⁃p53(Ser18)和acetyl⁃p53(K382)水平显著升高,K382乙酰化位点会影响p53泛素化结合,导致其泛素化被抑制;最终p53积累导致NSC34细胞和SMA小鼠脊髓组织中细胞周期阻滞和凋亡增加。结论SMN蛋白缺失通过抑制p53泛素化降解途径导致其积累,进而引起细胞周期阻滞和凋亡。

氯化两面针碱通过抑制p53泛素化降解诱导宫颈癌细胞凋亡的机制

目的探究氯化两面针碱(nitidine chloride,NC)对宫颈癌细胞凋亡的影响及其作用机制。方法以宫颈癌细胞系HeLa及SiHa为对象,通过CCK-8法和克隆形成实验检测NC的细胞毒性作用及对细胞生长的抑制作用。通过TUNEL法检测NC对宫颈癌细胞凋亡的影响,并采用Western blot法检测凋亡相关蛋白表达情况。运用免疫共沉淀实验、泛素化实验及Western blot实验分析NC对宫颈癌细胞中p53与E6AP蛋白相互作用、p53泛素化修饰水平、p53蛋白稳定性的影响。结果NC可明显抑制宫颈癌细胞增殖、诱导宫颈癌细胞凋亡,可抑制宫颈癌细胞中抑癌蛋白p53与泛素蛋白连接酶E6AP相互作用,降低p53泛素化修饰水平,延缓p53降解,增加p53蛋白表达水平。结论NC可通过抑制p53泛素化降解,提升p53蛋白表达水平,恢复其抑癌功能,发挥抗宫颈癌作用。

小麦泛素融合降解蛋白基因全长cDNA的克隆及分析

实验利用RT PCR技术,在小麦矮苏3品种中克隆了1个编码泛素融合降解蛋白基因的cDNA,并且含有完整的5′端,将该基因命名为Tufd1,利用RACE技术克隆了该cDNA的3′端。根据这2段cDNA克隆,设计特异引物,利用RT PCR扩增出了Tufd1完整的开放读码框(ORF),其编码区长948bp,编码315个氨基酸的多肽,在NCBI中运行BLAST。分析表明,Tufd1蛋白同拟南芥的UFD1蛋白有74%的同源性,在所编码的多肽链的N 端有UFD1保守结构域,可作为催化蛋白降解的信号。

中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞P53泛素化降解途径的实验研究

目的从细胞生物学及分子生物学水平探讨中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞增殖抑制及P53泛素化降解途径中各个蛋白表达的情况,研究中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞生长的调节作用。方法以4%含药血清培养液作用于SiHa细胞,设立正常对照组、空白血清组、清毒栓组及保妇康组、安达芬组,通过MTT法检测含药血清对细胞增殖抑制的影响;同时运用Western-Blot的方法检测HPV16E6、P53、UBcH8、E6-AP蛋白的表达情况。结果经含药血清培养液作用后各组细胞数量减少,其中以4%浓度含药血清作用72h时对细胞抑制作用最强,与空白血清组比较,差异有统计学意义(P<0.01);同时含药血清可升高P53、UBcH8蛋白的表达,降低HPV16E6、E6-AP的表达。结论清毒栓含药血清可能是通过调控P53泛素化降解途径而达到抑制肿瘤的目的。

缺血性中风病急性期泛素融合降解蛋白的临床意义

在脑缺血发生的急性期,缺血、缺氧的程度越严重,神经元细胞死亡越多,细胞内重要非溶酶体蛋白水解途径泛素-蛋白酶体系统(UPS)功能受损越严重,泛素融合降解蛋白(UFD1)是UPS的重要组成部分,其作为与神经细胞凋亡相关的生物学指标则表现的相关性就越强,UFD1可能与缺血性中风病急性期神经功能缺损程度及证候程度、证候变化密切相关。在缺血性中风病急性期动态监测血清UFD1变化时同步利用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)、缺血性中风证候评价量表进行中风病疾病、证候疗效动态评价,探讨生物学指标UFD1血清水平与NIHSS评分、证候评分的相关性,即可明确UFD1在中风病急性期中"病证"疗效评价中的价值。

泛素融合降解蛋白基因UFD1对植物抗病和抗逆性的调控功能分析

采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)克隆获得1个番茄泛素融合降解蛋白(ubiquitin fusion degradation protein,UFD)基因片段UFD1,并应用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术分析该基因对植物抗病性和抗逆性的调控功能.结果表明:在本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株中UFD1基因的沉默导致Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介导的过敏性反应(hypersensitive response,HR)以及水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)诱导的HR显著减弱,烟草野火病坏死症状明显减轻,在高盐胁迫下叶片叶绿素含量显著降低,但对菌核病病害症状以及抗干旱能力的影响不明显.表明UFD1基因是植物抗病和抗逆性的重要调控因子,它可能对Cf-4/Cf-9介导的基因对基因抗性、对Xoo的非寄主抗性和耐盐性起正向调控作用,而对烟草野火病抗性起负调控作用.

小麦泛素融合降解蛋白基因的克隆及特征分析

酵母UFDI基因编码的泛素融合降解蛋白是泛素依赖性降解系统或泛素融合降解途径中的一个关键因子。利用RT-PCR技术在小麦(Triticum aestivum L．)中分离到一个UFD1类似基因。该基因的编码区长948bp，编码长315个氨基酸的多肽，其氨基酸序列与GenBank中登录的一个拟南芥UFD1类似蛋白有74％的同源性。在多肽链的N-端具有在真核生物中高度保守的UFD1结构域。我们将该基因定位在小麦的第六染色体群并将其命名为TUFD1。Southern杂交和数据库搜索表明植物的UFD1基因是单拷贝或低拷贝的。无论是在单子叶中还是在双子叶植物中，UFD1蛋白都高度同源。除了N端UFD1结构域外，该类蛋白还有3个高度保守的C端结构域。TUFD1基因在小麦幼苗的根、茎、胚芽鞘、叶片以及幼穗和腊熟期子粒中呈组成性表达。

E3泛素连接酶接头蛋白SPOP介导的底物非降解型泛素化修饰

蛋白质的翻译后修饰是保证其能正常行使功能的前提,泛素化修饰是维持细胞正常蛋白质水平和活性的重要翻译后修饰类型。近年来,大量研究发现,E3泛素连接酶斑点型锌指结构蛋白(speckle-type POZ protein,SPOP)在诸多肿瘤与遗传疾病中存在突变,这些突变主要集中在识别底物的MATH结构域影响了与底物之间的结合,进而影响底物的蛋白质水平、定位及活性,并扰乱正常生理功能从而诱发疾病。野生型SPOP能正常结合底物,这些底物绝大多数由SPOP泛素化后进入蛋白酶体途径降解,而也有个别重要底物泛素化后仅是影响其功能改变而并非蛋白质水平的变化。鉴于SPOP在细胞内的重要功能,本文将对SPOP的底物泛素化修饰类型及功能进行详细介绍。包括:泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS),SPOP的结构、功能和作用途径以及SPOP的非降解型泛素化修饰。重点围绕SPOP的3个非降解底物:髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88)介导的NF-κB信号通路、组蛋白macroH2A1(macroH2A.1 histone,macroH2A1)的X染色体沉默信号通路,以及成蛋白INF2(inverted formin 2)介导的线粒体分裂融合等信号通路,将其抑制肿瘤发生发展的分子机制进行总结,以期为肿瘤精准靶向治疗提供新思路。

Cullin5介导PD-L1泛素化降解对胶质母细胞瘤放射敏感性的影响

目的探究Cullin5对胶质母细胞瘤细胞放射敏感性的影响及其相关机制。方法将flag-NC质粒、过表达(flag-Cullin5)质粒分别转染至胶质母细胞瘤U251细胞,建立flag-NC组、flag-Cullin5组,通过实时反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测细胞中Cullin5和程序性死亡配体1(PD-L1)的mRNA和蛋白表达水平。U251细胞接受0、2、4、8 Gy X线照射后,通过CCK-8法检测细胞存活率,通过流式细胞术检测细胞凋亡率。采用免疫共沉淀法检测Cullin5和PD-L1的相互作用,泛素化实验探究Cullin5对PD-L1的泛素化效应。将过表达PD-L1(oe-PD-L1)和flag-Cullin5的质粒转染至U251细胞,建立flag-Cullin5组、flag-Cullin5+oe-NC组和flag-Cullin5+oe-PD-L1组,通过RT-qPCR和WB检测细胞中Cullin5和PD-L1的mRNA和蛋白表达水平。经X线照射各组U251细胞后,通过CCK-8法检测细胞存活率,通过流式细胞术检测细胞凋亡率。采用LSD-t检验或单因素方差分析统计两组间或多组间差异。结果与flag-NC组比较,flag-Cullin5组细胞中Cullin5 mRNA和蛋白表达水平升高,PD-L1蛋白表达水平降低(P<0.05);经4、8 Gy X线照射后,细胞存活率降低,细胞凋亡率升高(P<0.05)。Cullin5的免疫沉淀物中存在PD-L1蛋白,PD-L1的免疫沉淀物中存在Cullin5蛋白。与flag-NC组比较,flag-Cullin5组细胞中PD-L1蛋白泛素化水平升高。与flag-Cullin5组比较,flag-Cullin5+oe-PD-L1组细胞中PD-L1 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05);经4、8 Gy剂量的X线照射后,细胞存活率升高,细胞凋亡率降低(P<0.05)。结论Cullin5通过介导PD-L1的泛素化降解,增强胶质母细胞瘤细胞的放射敏感性。

抑制端粒酶催化亚基的表达促进Survivin蛋白的降解

背景与目的:研究表明,在肿瘤细胞中端粒酶催化亚基(hum antelom erase reverse transcriptase,hTERT)与存活素(Survivin)的表达具有相关性,本研究拟探索肿瘤细胞中hTERT与Survivin在功能上是否存在相互调控作用。方法:采用反义核酸分别抑制survivin与hTERT在H eLa S3细胞中的表达,端粒重复扩增法检测细胞中端粒酶活性的变化,并分别采用W estern印迹与RT-PCR分析细胞中Survivin蛋白水平与m RNA水平的变化,M TT法检测H eLa S3细胞的增殖变化。结果:采用反义核酸抑制H eLa S3细胞中survivin的表达对端粒酶的活性没有影响,但是采用反义核酸No.14抑制hTERT的表达可以显著降低细胞中Survivin蛋白水平,而m RNA水平未受影响。而且当反义核酸No.14的浓度在200～1000nm ol/L范围内时,Survivin蛋白水平的下降与反义寡核苷酸的浓度呈正相关,这种下降可以被泛素化蛋白酶抑制剂lactacystin和M G132所抑制。此外,在H eLa S3细胞中同时抑制hTERT与survivin的表达可以协同性地抑制细胞增殖。结论:抑制H eLa S3细胞中hTERT的表达可以促使Survivin蛋白通过泛素蛋白酶体途径降解。

烧伤早期大鼠骨骼肌组织泛素转录表达的变化研究

目的 :研究烧伤后大鼠骨骼肌组织泛素蛋白酶体 (ubiquitin proteasome)蛋白降解途径组成成分中泛素表达的变化 ,探讨烧伤后骨骼肌蛋白降解的增强与泛素蛋白酶体蛋白降解途径表达变化间的关系。方法 :借助烫伤大鼠动物模型 ,利用骨骼肌离体孵育系统 ,应用氨基酸自动分析仪测定孵育液和骨骼肌组织中酪氨酸(Tyr)和 3甲基组氨酸 (3MH)量的变化 ,用 RNA印迹技术 (Northern blot)方法测定骨骼肌组织中泛素m RNA表达水平。结果 :烧伤后大鼠骨骼肌释放 Tyr和 3MH增多 ,以 3MH增加显著 ;烧伤后骨骼肌组织中泛素 2 .4kb的 m RNA表达上调明显。泛素 m RNA表达增加量与 Tyr和 3MH增加量间均呈显著正相关。结论 :烧伤后大鼠骨骼肌蛋白降解明显增强 。

基于疏水标签的Bcl-2/Mcl-1蛋白泛素化降解剂

Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1是重要的抗肿瘤靶标。本研究以一个非选择性的Bcl-2家族蛋白抑制剂为基础,设计合了4种不同结构的基于疏水标签的Bcl-2/Mcl-1蛋白泛素化降解剂S1-D1~S1-D4,在乳腺癌细胞模型MCF-7上考察了其诱导Bcl-2和Mcl-1蛋白泛素化降解和肿瘤细胞凋亡的能力。结果显示,尽管S1-D1~S1-D4均保持了对Bcl-2家族蛋白广谱的亲和力,但引入不同的连接子导致S1-D1~S1-D4实现了对Bcl-2和Mcl-1的选择性降解。其中,具有疏水烷基链的S1-D2分子对Bcl-2的降解能力最强,加入3μmol·L^(-1)时能够降解超80%的Bcl-2蛋白,而具有聚乙二醇链连接子的化合物S1-D4则表现出对Mcl-1蛋白的特异性降解,加入3μmol·L^(-1)时降解了约60%的Mcl-1蛋白。细胞毒性实验证明基于疏水标签的蛋白降解剂能够通过诱导靶蛋白的降解获得更强的肿瘤细胞杀伤活性,揭示了降解剂相比于抑制剂分子的优势。

泛素蛋白连接酶MDM2活性及稳定性调控的研究进展

泛素蛋白连接酶MDM2(Murine double minute 2)具有癌基因活性,MDM2高表达会导致抑癌基因p53失活而诱发肿瘤,但在至少7%的肿瘤中p53基因正常而mdm2异常扩增,表明MDM2还具有其他底物分子,以p53不依赖的方式促进肿瘤的发生。鉴于MDM2的重要作用,文章在基因水平、转录水平、翻译后修饰水平、相互作用分子的调节等方面系统总结了目前对MDM2调控的主要研究机制及其进展。

E3泛素连接酶Smurf家族在骨形态发生蛋白和转化生长因子信号转导中的作用

泛素-蛋白酶体降解系统广泛存在于各种真核细胞中,参与调控细胞多种生理进程.作为该系统中行使调控降解功能的核心成员,E3泛素连接酶的重要作用已经越来越引起人们的重视.BMP和TGF-β是骨组织中调控成骨细胞和软骨细胞增殖、分化和凋亡的关键分子,通过不同的信号通路体系调控骨生理代谢,参与骨组织的多种生理进程.最近的研究表明,泛素-蛋白酶体降解系统在骨细胞和骨组织中具有十分重要的作用,E3泛素连接酶Smurf作为这一系统的核心,参与调控骨组织中BMP和TGF-β两个家族的分子信号转导过程.在前期成果的基础上,结合最新的研究进展,系统阐述了骨组织中E3泛素连接酶的发现,及其调控BMP和TGF-β信号通路的机制以及其对成骨细胞和软骨细胞增殖和分化的影响.

PLEK2通过c-Myc介导的正反馈回路促进头颈鳞状细胞癌发生发展及干性形成

背景与目的头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是全球高发的恶性肿瘤之一,具有预后不良、淋巴结转移率高以及早期复发的特点。然而,调控HNSCC发生发展的分子机制尚未明确。因此,揭示其潜在机制以寻找有治疗前景的新靶点具有重要意义。本研究主要探讨PLEK2(pleckstrin-2)在调控HNSCC发生发展中的作用。方法通过分析独立公共数据集以及内部队列,确定PLEK2在HNSCC表达情况及其临床意义。同时,使用体内外实验,包括细胞增殖、集落形成、Matrigel侵袭、肿瘤球形成、ALDEFLUOR检测、蛋白印迹分析,以及异种移植小鼠模型等方法,明确PLEK2在调控HNSCC细胞恶性生物学行为中的作用。另外,通过免疫共沉淀、环己酮霉素追踪分析、泛素化实验、染色质免疫沉淀–定量聚合酶链反应、荧光素酶报告基因实验和挽救实验等方法,阐明PLEK2在促进肿瘤发展中的潜在分子机制。结果在HNSCC组织中,PLEK2 mRNA和蛋白质表达水平较正常组织明显增加;PLEK2的过度表达与不良预后和治疗抗性显著关联。此外,PLEK2在维持HNSCC细胞的增殖、侵袭、上皮间质转换、癌症干细胞特征和肿瘤形成中发挥重要作用,并能改变癌细胞的代谢。在分子机制方面,PLEK2能与c-Myc结合,降低FBXW7(F-Box And WD Repeat Domain Containing 7)与c-Myc的相互作用,避免了c-Myc的泛素化和随后的蛋白酶体介导的降解。更进一步,PLEK2激活的c-Myc信号对于维持HNSCC细胞的恶性生物学行为至关重要。此外,c-Myc可结合到PLEK2启动子并促进其转录,形成了正反馈循环。结论我们揭示了PLEK2通过调控c-Myc促进HNSCC发生发展的分子机理,表明PLEK2可能成为HNSCC的潜在治疗靶点。

松材线虫Rbx1基因克隆及蛋白质结构分析

为鉴定潜在的松材线虫防治靶标基因,应用SL法克隆到松材线虫Rbx1,并完成Rbx1蛋白质结构分析。松材线虫Rbx1与泛素途径多个蛋白发生互作。通过Rbx1与E2的分子对接研究,共发现Rbx1与E2分子间存在3个氢键,Rbx1含有1个E2契合"口袋"。分子动力学模拟表明,Rbx1的氮末端是其功能区域。松材线虫Rbx1是潜在的防治靶标基因,以该区域为靶位点设计抑制子或可达到防治该线虫的目的。

细胞周期的调控及在核移植研究中的应用

细胞周期是生命活动中一个最重要的过程。以cyclin、CDK、CKI等细胞周期调控蛋白的相互作用推动着细胞周期时相的进展和时相之间的转变。这一过程受到严密的调控机制所监控。在核移植的研究中,对细胞周期进行调控,使细胞阻滞于某一特定时期有非常重要的意义。

植物COP9信号复合体的结构特征和功能

文章介绍植物COP9信号复合体(CSN)的结构特征及其与19S"盖子"结构相互关系,以及CSN参与的NEDD化/去NEDD化的过程研究进展。

利用酵母双杂交系统筛选油菜ATP6的相互作用因子

甘蓝型油菜波利马(Brassica napus pol.)细胞质雄性不育系是一种很有实用价值的油菜不育类型.目前关于其分子机制的研究已证实,线粒体ATP合成酶的一个亚基ATP6与其雄性不育相关.本实验以ATP6作为诱饵蛋白,应用酵母双杂交共转化的方法筛选与ATP6相互作用的蛋白质.在获得的阳性克隆中,发现了一个与拟南芥中未知基因AT3G47550所编码的蛋白质具有较高同源性的蛋白质.它含有RING HC的结构,可能在泛素-蛋白质降解途径与细胞质雄性不育间建立起了某种联系.

CacyBP/SIP研究进展

1996年,Filipek等从艾氏腹水瘤细胞中发现了一种30kDa的蛋白质,它可与钙周期素（calcyclin,又名S100A6）结合,故此命名为钙周期素结合蛋白（calcylin binding protein,