猪泛素C端水解酶L1基因的克隆与序列分析

从人泛素C端水解酶L1（UCH_L1）基因出发，在dbEST数据库中同源搜索，找到1条与人UCH_L1基因编码氨基酸同源性较高且在香猪背最长肌中表达的EST（BM194679）．通过电子克隆和进一步RT—PCR试验验证，获得猪UCH_L1基因全长cDNA序列，其全长1105bp，开放阅读框（ORF）位于60～728bp，编码223个氨基酸．同源性分析结果表明，与人、鼠UCH_L1基因cDNA编码区（CDS）同源性分别为91．2％和86．5％，蛋白质序列同源性均为96．6％．对该基因编码蛋白的结构和功能预测显示含有2个典型的疏水性区域，不含有信号肽，存在1个UCH—L1（pfam01088）保守结构域和多个磷酸化位点，属UCH—L1蛋白家族，故将该基因命名为猪泛素C端水解酶L1基因（登录号AY495532）．

泛素C端水解酶L1的RNA干扰载体的构建及效果评价

目的:获得抑制效果好的泛素C端水解酶L1(UCH-L1)基因小干扰RNA(siRNA)干扰载体。方法:根据Gen Bank中大鼠UCH-L1基因序列设计并合成4对siRNA寡核苷酸序列,将4对寡核苷酸序列退火成双链后分别插入siRNA表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR中构建4个siRNA表达质粒,测序鉴定后将4个siRNA表达质粒分别转染HEK293细胞,利用Western印迹和qPCR方法检测干扰效果;将干扰效果最好的质粒包装成腺病毒,感染大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),并采用TNFα干预诱导UCH-L1表达升高,Western印迹验证干扰效果。结果:测序分析证实4对siRNA寡核苷酸序列分别插入siRNA表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR;qPCR检测与Western印迹均表明第3号siRNA表达载体对UCH-L1表达的抑制程度最高,将其包装成腺病毒并转染VSMC能显著抑制TNFα诱导的UCH-L1表达升高。结论:构建并筛选出干扰效果好的UCH-L1 siRNA干扰载体。

胶质纤维酸性蛋白和泛素C端水解酶L1在轻中度创伤性脑损伤诊断中的应用

创伤性脑损伤(TBI)每年会影响全球数千万人,严重威胁人类健康,军人作为特殊群体尤为高发。目前,对于TBI的临床诊断主要依赖于计算机断层扫描(CT)和格拉斯哥昏迷量表(Glasgow Coma Score,GCS)。然而,CT检测的假阳性和患者暴露于电离辐射的高风险及GCS存在较大的主观性等限制了TBI尤其是轻中度TBI(mmTBI)的精准诊断。近年来,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和泛素C端水解酶L1(UCH-L1)正在成为新的TBI诊断血液标志物,其应用越来越广泛。该文梳理了GFAP和UCH-L1的理化性质、功能及其在TBI诊断中与已有标志物相比存在的优势,阐述了其在战时环境下的应用潜力,并展望了TBI快速诊断的研发趋势。