水稻内生成团泛菌YS19与菠萝泛菌YJ76共培养提高环境胁迫生存适应性

成团泛菌(Pantoea agglomerans)YS19和菠萝泛菌(Pantoea ananatis)YJ76是从水稻(Oryza sativa)“越富”品种中分离得到的2株优势内生固氮细菌。利用YS19和YJ76共培养方式模拟菌体栖息微环境,探索潜在的种间生物效应,发现适量的YJ76能够促进YS19共质体的形成并且YJ76细胞可以参与到YS19的共质体结构中,YS19 YJ76接种量比例为103时促进效果最为显著。相比之下,当使用吲哚产量显著下降的YJ76突变株Δzwf与YS19共培养时,上述促进效应均显著减弱。与单独培养相比,共培养显著提高了两个菌株对重金属Zn^(2+)、四环素、紫外线以及干燥的耐受能力,YS19分别提高了63.9%、56.0%、57.4%、72.0%,YJ76分别提高了147.9%、172.7%、266.3%、348.6%。结果表明水稻的两种主要内生菌YS19和YJ76在共栖息时表现为强烈的协同作用,而YJ76产生的吲哚信号分子在这个过程中起到重要调节作用。

小菜蛾肠道成团泛菌PxG45的分离鉴定及其抗真菌活性

【目的】昆虫肠道共生细菌是栖息在昆虫肠道中的微生物,是肠道微生物群落中最主要的成员。它们对昆虫的生长发育、营养吸收以及免疫系统均具有重要影响。本研究通过对小菜蛾Plutella xylostella肠道共生细菌进行分离培养和功能鉴定,以探究肠道共生细菌对小菜蛾适应性的影响及其对真菌的广谱抑制作用。【方法】利用体外平板培养分离纯化小菜蛾3龄幼虫肠道细菌PxG45菌株,结合形态学、16S rDNA基因测序和生理生化测定进行菌种鉴定。利用生物测定探究PxG45对小菜蛾3龄幼虫存活率及球孢白僵菌Beauveria bassiana侵染小菜蛾3龄幼虫对存活率的影响。通过平板对峙法检测PxG45对球孢白僵菌的抑制作用,进一步检测PxG45对植物病原真菌希金斯炭疽菌Colletotrichum higginsianum、刺盘孢炭疽菌C.camelliae、尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4、茄链格孢菌Alternaria solani、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae和丁香假单胞菌杨梅致病变种Pseudomonas syringae pv.myricae的广谱抗性。【结果】小菜蛾3龄幼虫肠道菌PxG45为成团泛菌Pantoea agglomerans。与未饲喂PxG45的对照组相比,饲喂PxG45不仅显著提高了健康小菜蛾3龄幼虫的存活率,还提高了球孢白僵菌侵染后3龄幼虫的存活率。与PxG45拮抗培养的球孢白僵菌和6种植物病原真菌的菌落直径均显著小于单独培养球孢白僵菌和6种植物病原真菌时的直径,与PxG45拮抗培养后真菌的生长均被抑制。【结论】成团泛菌PxG45通过直接的抑菌作用影响小菜蛾对外界的适应性,且这种抑菌作用具备广谱性,可显著抑制植物病原真菌的生长。本研究表明PxG45具备生防菌潜力,并为利用害虫肠道共生菌提供新思路。

分散泛菌胞内脱乙酰酶在大肠杆菌中重组表达条件优化及酶学特性

目的 对分散泛菌的胞内脱乙酰酶(PantoeadispersaN-acetylglucosaminedeacetylase,Pd-nagA)进行表达条件优化及酶学性质分析。方法 本研究使用聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)技术对分散泛菌全基因组中Pd-nagA基因序列进行全长扩增,将含有Pd-nagA基因的质粒pET-28a(+)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,同时采用单因素实验,优化诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)的浓度,采用Ni2+-次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid, NTA)进行重组酶的纯化,再对其酶学特性进行测定。结果 以pET-28a(+)质粒作为表达载体,大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了可溶形式的Pd-nagA蛋白,分子量约为40kDa。当诱导温度为28℃,诱导前菌液OD600值为1.2, IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导时间为20 h时, Pd-nagA蛋白得到了大量表达。通过薄层层析法分析表明Pd-nagA重组蛋白能够在体外转化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖,Pd-nagA重组蛋白能够在高盐溶液中保持一半的相对酶活性,该酶4℃储存10d的相对活性仍然保持在90%以上,具有良好的储存稳定性,催化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖反应条件简单快捷。结论 本研究成功异源表达了具有催化活性的Pd-nagA酶,并对表达条件进行优化及酶学特性探究,可为工业上单酶催化制备氨基葡萄糖提供一定的理论参考。

菠萝泛菌与水稻白叶枯病菌双重PCR检测方法的建立与应用

近年来水稻发生了一种由菠萝泛菌Pantoea ananatis引起的新型细菌病害,其发生时期与白叶枯病相近,病症与白叶枯病类似。为了实现该病害与白叶枯病的快速检测,本研究基于泛菌属看家基因acnA,通过序列比对,设计了22对特异性引物,分别与已知的白叶枯病菌检测引物XOO80进行配对并筛选,建立了一种双重PCR检测方法,可从菠萝泛菌和白叶枯病菌中分别扩增出910 bp和162 bp的特异性条带,而其他10种非目标细菌均未有扩增条带,25μL体系中可稳定地从至少1 pg/μL的基因组DNA模板中扩增出特异性条带。本研究建立的菠萝泛菌与水稻白叶枯病菌双重PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏度,为水稻细菌病害病原鉴定及防治提供了技术支撑。

陇南核桃致病性成团泛菌的分离鉴定及其致病性研究

本研究拟从核桃病叶中分离并鉴定其致病菌,以便更好地实施科学防治。以组织分离法分离核桃病叶中的成团泛菌,之后以形态学方法对该病菌进行形态学鉴定,并通过细菌16SrDNA序列分析进行分子鉴定。结果表明,该病原为成团泛菌Pantoea agglomerans。致病性测定结果表明:该菌致病时间短,危害较大。主要通过伤口侵入植株叶片组织使得寄主发病,而植株茎干的损伤对植株发病短期内无明显影响,通过根际土壤接种发现,该细菌并不能直接由根部进入植株体内。

成团泛菌引起的棉花烂铃病对棉花产量因子和品质的影响

成团泛菌(Pantoea agglomerans)引起的棉花烂铃病主要造成棉铃吐絮不畅,棉纤维变色,籽粒干瘪。本试验对感染该病害的不同棉花品种的发病率、绒长、单铃重、衣分以及色泽等指标进行测定,用SAS软件分析,结果显示:所有棉花品种都有烂铃病的发生,平均发病率为20.6%,不同品种间发病有明显的差别。病害对单铃重、衣分、瘪籽率、绒长及色泽的影响主要体现在单铃重平均减轻27.6%、衣分平均降低5.3%和瘪籽率平均增加1.6倍、绒长平均缩短1.6mm及平均颜色加深2.0%。由成团泛菌引起的这种细菌病害可引起棉花减产高达10%～20%。

产harpin的成团泛菌工程菌的构建

梨火疫病菌（ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ） 产生的胞外蛋白ｈａｒｐｉｎ 是引发其非寄主植物过敏反应的因子。ｈａｒｐｉｎ 蛋白还具有诱导植物抗性的功能。成团泛菌（ Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）３０８Ｒ 对链格胞属（ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ） 的真菌具有拮抗活性，是一株抗利福霉素的自发突变株，对壮观霉素敏感。本文通过电击转化法将带有梨火疫病菌ｈｒｐ 基因簇的重组质粒ｐＣＰＰ４３０ 导入３０８Ｒ。所得转化子具有ｐＣＰＰ４３０ 的壮观霉素抗药性标记，在番茄上引起过敏反应；从转化子中提取到与ｐＣＰＰ４３０ 大小一样的质粒，其酶切物理图谱也与ｐＣＰＰ４３０ 完全相同；用地高辛标记的ｈａｒｐｉｎ 的结构基因ｈｒｐＮ 为探针对转化子中的质粒进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析，结果在转化子中得到信号明显的杂交片段，而受体菌３０８Ｒ 中未出现杂交信号；提取细菌的外壁的蛋白质进行ＰＡＧＥ 分析，在大约４４ ｋｄ 的位置上３０８Ｒ（ｐＣＰＰ４３０） 比３０８Ｒ 明显多出１ 条带。这些结果表明成团泛菌能够表达梨火疫病菌的ｈｒｐ 基因簇，所产ｈａｒｐｉｎ

肉桂精油对成团泛菌和腐生葡萄球菌的抑菌活性及其机理

本文利用滤纸片法和二倍稀释法分别测定了肉桂精油对成团泛菌及腐生葡萄球菌的抑菌圈直径、最小抑菌浓度(MIC)以及最小杀菌浓度(MBC)来评估肉桂精油对其的抑菌活性,通过扫描电镜、透射电镜探究肉桂精油对成团泛菌和腐生葡萄球菌的形态影响,以及通过测定细胞膜的通透性、细胞膜的完整性和膜电位来共同阐释肉桂精油对两种菌活性抑制的机理。结果表明肉桂精油对成团泛菌和腐生葡萄球菌的生长均有较强的抑制作用,且对腐生葡萄球菌的抑菌作用明显强于成团泛菌的抑制作用;肉桂精油改变细胞的形态、增加膜的通透性、破坏了膜的完整性、并造成了细胞内容物的泄露、膜电位的降低,从而导致细菌的死亡。

成团泛菌低分子脂多糖的分离纯化和鉴定

目的 :从革兰阴性非致病菌成团泛菌中提取、分离和纯化出细菌脂多糖 ,开发一种新的免疫调节剂 Pantoea agglomeranslipopolysaccharide(L PSp)。方法 :用 westphal热酚水法粗提 ,阴离子交换层析法进行纯化。应用 Tricine- SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳法 (Tricine- SDS- PAGE)、鲎变形细胞溶解物实验法对 L PSp的相对分子质量及活性进行鉴定。同时对 L PSp的化学成分进行分析。结果 :获得相对分子质量为 5 0 0 0的低分子脂多糖 (L PSp)。经鉴定 L PSp为含有 1 8%2 - keto- 3- deoxyoctulosonate (KDO)、总糖量为 6 4 .5 %、总纯度 >99.0 7%、重量比活性较 E.coli O1 1 1 :B4 L PS高 2 .6倍。结论 :用阴离子交换层析法可纯化出低相对分子质量高纯度水溶性的成团泛菌脂多糖 L PSp,与其它细菌 L PS相比 L PSp具有较高的

一株拮抗姜瘟青枯劳尔氏菌的泛菌的分离及鉴定

从生姜田土中分离到一株对姜瘟青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacarum)有强拮抗作用的泛菌菌株Q6,对该菌株进行了形态特征、培养特征、生理生化特征的鉴定及16S rDNA序列的分析.以16S rDNA序列为基础构建了包括12株相关种属细菌在内的系统发育树,其中与11个泛菌属的菌株的16S rDNA序列的同源性为95.54%～99%.

成团泛菌(Pantoea agglomerans)对稻谷的致病性

分离自稻谷的成团泛菌 (Pantoea agglomerans)菌株的致病性测定结果表明 ,所有成团泛菌菌株对稻谷都有一定的致病力 ,但强弱差异明显 ,其中 FDQ1、FDSN4、XD2、XSH4菌株较强 ,XD2最强 .成团泛菌影响稻谷的灌浆与发育 ,水稻对该菌的易感期为孕穗期到抽穗初期 ,症状表现为抽穗迟、(半 )包穗、白穗、稻粒变色、秕谷率高等 ;该菌还影响稻种的萌发 ,表现为胚芽与胚根的伸长受到抑制 ,容易造成死苗 .成团泛菌对稻谷的污染部位主要集中在内、外颖组织上 .要使该菌保持较强致病力 ,菌液接种菌量应不低于 1 0 8CFU·m L- 1 .

海洋细菌成团泛菌(Pantoea agglomerans)中环二肽类代谢产物的研究

目的研究海洋细菌成团泛菌（Pantoea agglomerans）发酵液的乙酸乙酯萃取物中的化学成分,以期得到有活性的先导化合物。方法采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、高效液相色谱等方法进行分离纯化,通过理化性质和波谱数据分析鉴定化合物的结构。结果从海洋细菌Pantoea agglomer-ans的乙酸乙酯萃取物中分离得到10个环二肽类化合物,分别鉴定为环-（苯丙氨酸-脯氨酸）[cy-clo（Phe-Pro）,1]、环-（缬氨酸-脯氨酸）[cyclo（Val-Pro）,2]、环-（丙氨酸-亮氨酸）[cyclo（Ala-Leu）,3]、环-（色氨酸-脯氨酸）[cyclo（Trp-Pro）,4]、环-（色氨酸-甘氨酸）[cyclo（Trp-Gly）,5]、环（4-羟基-脯氨酸-苯丙氨酸）[cyclo（4-hydroxyl-Pro-Phe）,6]、环-（脯氨酸-酪氨酸）[cyclo（Pro-Tyr）,7]、环-（亮氨酸-亮氨酸）[cyclo（Leu-Leu）,8]、环-（脯氨酸-亮氨酸）[cyclo（Pro-Leu）,9]、环-（缬氨酸-异亮氨酸）[cyclo（Val-Ile）,10]。结论化合物1~10均为首次从海洋细菌Pantoea agglomerans中分离得到。

对从甘蔗根部分离的固氮成团泛菌的研究

从甘蔗根部分离的固氮菌株Ｗ１１，经细菌自动鉴定系统根据９６个生化试验指标，鉴定为成团泛菌。该菌株耐酸（ｐＨ３．５），耐高蔗糖浓度（３０％），产酸使培养基的酸度降低到ｐＨ４．４１，３．１ｍｍｏｌＮＨ４ＮＯ３或５８．８ｍｍｏｌＮａＮＯ３能抑制固氮酶活性。在培养基的蔗糖浓度为１０％，谷氨酸钠０．２５ｇ／Ｌ，ｐＨ５．５，２８～３０℃条件下，该菌株生长最佳，固氮酶活性最高。在耐高蔗糖浓度，耐酸，碳源利用。

成团泛菌(Pantoea agglomerans)对镉胁迫下蒌蒿耐受性的影响

为探讨功能微生物对镉（Cd）胁迫下蒌蒿耐受性的影响,以成团泛菌（Pantoea agglomerans）J2为对象,通过盆栽试验,研究不同Cd处理水平下J2菌对蒌蒿生长、生理、Cd富集转运与根际微生态的影响。结果表明：J2菌可显著促进蒌蒿株高、地上部干重、地下部干重、总生物量及根冠比的增加。在J2菌的作用下,蒌蒿叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性均显著增加,丙二醛（MDA）含量明显减少。J2菌可显著促进蒌蒿对Cd的富集转运,蒌蒿地上部、地下部与总Cd含量均显著增加,地上部生物富集系数（BCF）明显大于地下部,转运系数（TF）相比于对照增加了7.5%-37.4%。J2菌可显著增加蒌蒿根际土壤细菌、放线菌数量及微生物总量,明显减少真菌数量。研究表明成团泛菌J2对蒌蒿生长、生理、Cd富集转运与根际微生态可产生积极影响,在一定程度上可提高蒌蒿植株对Cd的耐受性。

水稻内生优势成团泛菌GFP标记菌株的性质与标记丢失动力学

为研究内生细菌对宿主植物侵染定殖的机理和其共生生物学作用 ,对水稻内生优势成团泛菌 (Pantoeaagglomerans)YS19与绿色荧光蛋白 (GFP)标记的YS19B ::gfp菌株的生长动力学进行了比较研究 ,探讨了成团泛菌YS19B ::gfp的标记稳定性和荧光性质 .标记菌株与野生型菌株相比 ,最大比生长速率和最大生物量仅减小 12 4 %和 6 % ,代时延长 14 0 % .成团泛菌YS19B ::gfp在指数期连续传代培养 10 0代后 ,GFP标记的保持率为 89 1% ,建立了标记菌株在有标记丢失存在时的生长动力学模型 :dX+ dt =μ+ (1-p)X+ ,解析出细胞分裂时标记丢失的概率p =9 75 6× 10 -7,确定了方程的模型参数 .标记菌株的荧光光谱在激发波长为 4 0 0nm时 ,最大发射波长为 5 0 8nm ,与供体菌株完全相同 .在LB培养基上生长时 ,成团泛菌YS19B ::gfp的GFP产生时间在指数期末期到稳定期较快 ,并于培养至 2 0h时达到最高 ,同时单位菌体生物量的荧光强度也达到最大 .结果说明 ,在GFP标记后成团泛菌YS19B ::gfp的生长仅受到较小影响 ,不致对成团泛菌的生理活动造成大的改变 ,同时由于该菌对宿主的侵染能力比其它内生细菌要强得多 ,因而该菌对植物的侵染活性影响也较小 ,该菌仍然可以保持其内生优势地位 .该标记的稳定性比较高 ,荧光产生正常 ,很适?

成团泛菌低分子脂多糖的急性毒性、刺激性、致敏性及遗传毒性评估

本研究对成团泛菌低分子脂多糖(Pantoea agglomerans lipopolysaccharide,LPSp)的安全性进行初步评估。本研究采用一次限量法,用昆明种小鼠进行LPSp急性经口毒性试验,了解LPSp的急性毒性;采用新西兰兔分别进行LPSp急性和多次皮肤刺激性试验以及急性眼刺激性试验,了解LPSp的皮肤和粘膜刺激性;采用豚鼠进行LPSp皮肤变态反应试验,了解LPSp的致敏性;应用平板掺入法进行鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验和小鼠骨髓细胞微核试验考察LPSp的遗传危害。急性毒性试验结果显示,LPSp对小鼠经口一次灌胃的LD50大于5000mg/kg体重,属实际无毒级别;LPSp急性和多次皮肤刺激性试验以及急性眼刺激性试验结果显示,皮肤刺激和眼刺激积分均为0分,LPSp对皮肤无刺激性、对眼睛无急性刺激性;在皮肤变态反应试验中,LPSp在各观察时间点的皮肤变态反应积分均为0分,其致敏率均为0%,说明LPSp对豚鼠无致敏性;LPSp的鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验结果呈阴性(P>0.05);LPSp的小鼠骨髓细胞微核试验结果亦呈阴性,LPSp各剂量组的微核发生率与阴性对照组未见统计学差异(P>0.05),而与阳性对照组有明显差异(P<0.01)。本研究结果表明,在本实验剂量范围内,LPSp对小鼠经口毒性极低,属实际无毒级别,对家兔皮肤和眼睛无明显刺激性,对豚鼠无致敏性,对所试菌株和小鼠体细胞无诱变性和致突变性。

内生成团泛菌YS19对水稻乳熟期光合产物在旗叶、穗分配中的影响

从水稻植株中分离的内生成团泛菌YS19可以分泌4种激素类物质,分别是生长素(IAA)、细胞脱落酸(ABA)、赤霉素(GA_4)和细胞分裂素(CTK),其中,细胞分裂素有3种,即异戊烯腺嘌吟(iP)、玉米素核苷(ZR)和二氢玉米素核苷(HDZR),在水稻籽粒灌浆时期喷施YS19菌液后,观察到水稻内生成团泛菌可以调控光合产物在旗叶(源)、穗(库)中的分配,在水稻籽粒乳熟初期喷施YS19菌液对库的建成具有促进作用,而在水稻籽粒乳熟后期则具有抑制作用,其原因与YS19菌株产生的激素有关。

固定化泛菌对底泥中孔雀石绿的降解

用2%海藻酸钠对孔雀石绿高效降解菌Pantoea sp.EF192586菌株进行固定化包埋,研究固定菌对底泥中孔雀石绿的降解情况。研究结果表明:固定菌对底泥中不同浓度孔雀石绿均有降解,且0.45和0.95μg/g干重降解率更好,达80%。增加固定菌的投菌量可提高降解速率和降解率,但当投菌量增至1.5g后降解率不再增加。泥水系统中水量减少可以提高固定菌起始阶段的降解速率。当固定菌和光照联合作用时可以提高降解率。

产harpin的成团泛菌工程菌308R(pCPP430)遗传稳定性的研究

成团泛菌工程菌３０８Ｒ（ｐＣＰＰ４３０）带有梨火疫欧文氏杆菌的与过敏反应和致病性有关的基因簇 （ｈｒｐ），可以产生能诱导植物抗病性的蛋白质ｈａｒｐｉｎ。该工程菌在ＬＢ液体培养基中生长５０代后，带有重 组质粒ｐＣＰＰ４３０的细胞占总菌量的 １％，带有载体ｐＣＰＰ９的细胞为４６％。工程菌喷雾到番茄叶面，保湿条 件下叶面菌量维持在 １０５ｃｆｕ／ｃｍ２以上，其中带有 ｐＣＰＰ４３０质粒的菌维持在 ４０％以上，带有 ｐＣＰＰ９载体的 菌维持在８０％以上。因此，携带ｈｒｐ基因簇的质粒ｐＣＰＰ４３０在宿主菌中是不稳定的。文中讨论了改进工 程菌遗传稳定性的途径。

生防菌成团泛菌XM2抗菌蛋白抗真菌特性研究

以成团泛菌XM2为研究对象,采用硫酸铵分级沉淀和生长速率法对其次级代谢产物中抗菌蛋白的最佳硫酸铵沉淀质量浓度和抗真菌特性进行了研究。结果表明,该抗菌蛋白最佳硫酸铵沉淀质量浓度为209.4 g·L-1;具有较好的抑菌广谱性,对梨黑斑病菌、辣椒疫病菌、西瓜枯萎病病菌以及辣椒枯萎病菌具有90%以上的抑菌活性;在温度低于80℃、pH值为4~9.5、紫外照射24 h以及蛋白酶K和胰蛋白酶处理后均可保持85%以上的抑菌活性。