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牛泡沫病毒反式激活因子在内部启动子上应答元件的研究 被引量:4
1
作者 张莉 乔文涛 +3 位作者 刘淑红 王金忠 陈启民 耿运琪 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第3期232-237,共6页
泡沫病毒的基因转录依赖至少两个不同的启动子 :LTR调节病毒结构蛋白的表达 ,而内部启动子 (IP)则起始调节蛋白mRNA的转录。牛泡沫病毒 (BFV)在env与 3′LTR之间有两个重叠的开放阅读框架orf 1和orf 2 ,分别编码BFVORF 1、ORF 2等多种... 泡沫病毒的基因转录依赖至少两个不同的启动子 :LTR调节病毒结构蛋白的表达 ,而内部启动子 (IP)则起始调节蛋白mRNA的转录。牛泡沫病毒 (BFV)在env与 3′LTR之间有两个重叠的开放阅读框架orf 1和orf 2 ,分别编码BFVORF 1、ORF 2等多种调节蛋白。这些蛋白中BFVORF 1为转录激活因子 ,称为Tas。Tas对LTR及IP均有反式激活作用。BFV中第二类启动子IP的存在反映了泡沫病毒基因调控的复杂性。已从BFV3 0 2 6中国毒株中克隆了基因组区段 85 72~ 95 0 9,并通过测序和功能分析证明该区段包含了BFVIP。为了对IP进行更精确的定位 ,对其进行了进一步的缺失分析 ,将完整的IP定位在 9117~ 940 5之间。该启动子的TATA盒位于 912 80~92 85 ,是IP必不可少的元件之一。杂合启动子和缺失分析表明 ,TATA盒上游 16 0bp的区域内包含了IP的Tas应答元件 (TREIP) ,其功能类似于增强子。Tas对IP具有强烈的激活作用 ,而C端缺失的ORF 1蛋白或ORF 2蛋白均不足以激活IP的表达。 展开更多
关键词 泡沫病毒 内部启动子 转录激活因子 (Tas)
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Borf-1蛋白是牛泡沫病毒的反式激活因子 被引量:3
2
作者 刘佳建 刘淑红 +1 位作者 陈启民 耿运琪 《科学通报》 EI CAS CSCD 北大核心 1999年第8期844-847,共4页
以近来分离并鉴定的BFV30 2 6中国毒株为材料 ,用PCR方法扩增BFV5′全长LTR( - 983/+ 32 2 )及非结构基因Orf 1 ,Orf 2 ,构建带不同长度LTR的克隆质粒及Borf_1 ,Borf_2等非结构蛋白表达质粒 ,引入Luc基因为报告基因做瞬时表达分析 .首... 以近来分离并鉴定的BFV30 2 6中国毒株为材料 ,用PCR方法扩增BFV5′全长LTR( - 983/+ 32 2 )及非结构基因Orf 1 ,Orf 2 ,构建带不同长度LTR的克隆质粒及Borf_1 ,Borf_2等非结构蛋白表达质粒 ,引入Luc基因为报告基因做瞬时表达分析 .首次证明BFV编码的 2 49个氨基酸的Borf_1蛋白即为自身的反式激活因子 ,并且发现Borf_1反式激活作用的正调控元件位于LTR的U3区 - 1 40上游 ( + 1为转录起点 ) ,负调控元件位于转录起点下游 + 2 9/+ 32 3(RU5区 ) . 展开更多
关键词 泡沫病毒 Borf-1蛋白 激活因子
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牛泡沫病毒LTR的反式激活因子靶序列研究(英文) 被引量:1
3
作者 刘佳建 耿运琪 《南开大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 1999年第2期87-92,共6页
牛泡沫病毒(BFV)是反转录病毒科泡沫病毒属成员之一.其基因组除编码gag,pol,env三个结构基因外,在env和3'LTR之间有2个ORF(ORF-1和ORF-2),编码自身的反式激活因子Tas等调节蛋白.本研究... 牛泡沫病毒(BFV)是反转录病毒科泡沫病毒属成员之一.其基因组除编码gag,pol,env三个结构基因外,在env和3'LTR之间有2个ORF(ORF-1和ORF-2),编码自身的反式激活因子Tas等调节蛋白.本研究利用我们实验室分离鉴定的BFV3026中国毒株[12]为材料,克隆Orf-1基因,构建pBFVORF-1表达质粒,通过带有luc基因的LTR系列缺失质粒与pBFVORF-1共转染,瞬时表达分析结果将BFVLTR上Tas应答元件(TRE)定位于-983/-668(TREI),-470/-140(TREI)和RU5区.其中TREI、TREII为正调控区域,RU5为负调控区域,并进一步证明RU5在异源启动子(BIVLTR)上具有抑制其下游基因表达的功能.这些结果表明BFVTas作用机理与慢病毒(Tat)。 展开更多
关键词 病毒 泡沫病毒 长末端重复序列 激活因子
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α-Enolase抑制人泡沫病毒反式激活因子Bell介导的反式激活作用 被引量:1
4
作者 吴亚锋 张其程 +3 位作者 李哲 汤书兵 许丰雯 陈启民 《南开大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期86-91,共6页
泡沫病毒能在宿主细胞内长期潜伏感染,且不伴随任何病理现象.为了阐明这一病毒潜伏感染机制,关键要研究病毒与其宿主之间的相互影响,尤其是宿主对病毒基因转录水平的影响.Bel1是人泡沫病毒的反式激活因子,它能够激活该病毒LTR和IP两个... 泡沫病毒能在宿主细胞内长期潜伏感染,且不伴随任何病理现象.为了阐明这一病毒潜伏感染机制,关键要研究病毒与其宿主之间的相互影响,尤其是宿主对病毒基因转录水平的影响.Bel1是人泡沫病毒的反式激活因子,它能够激活该病毒LTR和IP两个转录启动子.该研究利用酵母双杂交技术筛选到Bel1的相互作用蛋白α-Enolase,并用免疫共沉淀技术确定了这两个蛋白的结合涉及α-Enolase的243~372位氨基酸及Bel1的223~275位氨基酸.细胞转染实验发现α-Enolase蛋白能够抑制Bel1介导的反式激活作用. 展开更多
关键词 泡沫病毒 泡沫病毒激活因子 α-Enolase
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核因子кB介导病毒基因反式激活途径在激素敏感型单纯性肾病发病中的作用 被引量:7
5
作者 刘晓鸣 王峥 李缠生 《四川大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期183-186,共4页
目的研究核因子кB(NF-кB)介导的病毒基因反式激活途径在激素敏感型单纯性肾病(SRSNS)发病中的作用,探讨呼吸道病毒触发该病的机制。方法采用电泳迁移率改变分析、RT-PCR和ELISA法分别对SRSNS、肾炎性肾病、继发性肾小球疾病、毛细支... 目的研究核因子кB(NF-кB)介导的病毒基因反式激活途径在激素敏感型单纯性肾病(SRSNS)发病中的作用,探讨呼吸道病毒触发该病的机制。方法采用电泳迁移率改变分析、RT-PCR和ELISA法分别对SRSNS、肾炎性肾病、继发性肾小球疾病、毛细支气管炎和正常儿童外周血单个核细胞(PBMC)NF-кB转录活性、呼吸道病毒基因和抗体表达、血清IL-8水平进行检测。结果1SRSNS活动期NF-кB转录活性增高,与SRSNS恢复期、缓解期和其它组比较差异有统计学意义(P<0.05);2SRSNS活动期血清IL-8水平增高,与NF-кB转录活性呈直线正相关关系(r=0.88,P<0.001),NF-кB活性与呼吸道病毒检出阳性率亦呈正相关趋势。结论NF-кB介导的病毒基因反式激活途径能使IL-8等基因表达增高而致病,这可能是呼吸道病毒触发SRSNS的主要机制之一。 展开更多
关键词 因子kB(NF-kB) 病毒基因激活 激素敏感型单纯性肾病 呼吸道病毒
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核因子-κB/抑制蛋白-κB信号通路介导的激素敏感型单纯性肾病患儿病毒基因反式激活 被引量:3
6
作者 陶于洪 王峥 +1 位作者 李缠生 朱小石 《实用儿科临床杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第17期1130-1132,共3页
目的研究核因子-κB(NF-κB)/抑制蛋白-κB(IκB)信号通路在激素敏感型单纯性肾病(SRSNS)患儿病毒基因反式激活中的作用。方法采用电泳迁移率改变实验、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶标记免疫吸附分析法(ELISA)分别测定SRSNS、肾炎... 目的研究核因子-κB(NF-κB)/抑制蛋白-κB(IκB)信号通路在激素敏感型单纯性肾病(SRSNS)患儿病毒基因反式激活中的作用。方法采用电泳迁移率改变实验、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶标记免疫吸附分析法(ELISA)分别测定SRSNS、肾炎性肾病、继发性肾小球疾病、毛细支气管炎和正常儿童外周血单个核细胞(PBMCs)NF-κB活性、呼吸道病毒基因和血浆病毒抗体;同时采用Western blot和ELISA分别检测SRSNS和正常儿童IκBα蛋白质表达和血浆IL-8水平。结果与SRSNS缓解期和其他组比较,SRSNS活动期组NF-κB活性明显增加。NF-κB活性与呼吸道病毒检出阳性率呈正相关趋势。SRSNS活动期血浆IL-8水平增高,且与NF-κB活性呈正相关(r=0.88 P<0.001)。SRSNS活动期患儿IκBα蛋白质明显低于SRSNS缓解期和正常儿童,IκBα蛋白质水平与NF-κB活性呈负相关(r=-0.884 P<0.05)。结论NF-κB/IκB信号通路介导的病毒基因反式激活过程,可能是呼吸道病毒触发SRSNS的主要机制之一。 展开更多
关键词 肾病 单纯性 激素敏感型 抑制蛋白-κB 因子-ΚB 病毒基因激活 呼吸道病毒
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牛免疫缺陷病毒反式激活因子作用机理的研究 被引量:2
7
作者 梁臣 耿运琪 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1995年第4期327-335,共9页
牛免疫缺陷病毒(Bovineimmunodeficiencyvirus,BIV)基因组编码的反式激活因子(transactivator,Tat)可以提高BIV长末端重复区(longterminalrepeat,LTR... 牛免疫缺陷病毒(Bovineimmunodeficiencyvirus,BIV)基因组编码的反式激活因子(transactivator,Tat)可以提高BIV长末端重复区(longterminalrepeat,LTR)启动子的表达。为研究BIVTat蛋白的作用机理,分别从BIVLTR5′端及3′端构建不同的缺失,从荧光素酶基因(luciferase,Luc)为报道基因,通过共转染小牛肺细胞检测BIVLTR中与Tat蛋白反式激活作用相关的序列。转染结果表明BIVLTR启动子始于-52位的上游区不显著影响Tat蛋白的激活作用,转录起始点下游的序列与Tat蛋白的激活作用密切相关;并且-2-+32间的序列为BIVTat蛋白靶序列的一部分。将BIVLTR启动子下游序列(-2-+204)亚克隆到HIV-1LTR启动子-5位之后,BIVTat蛋白可极大地提高该杂合启动子表达,进一步说明BIVTat蛋白的靶序列存在于-2-+204的范围内;同时将BIVLTR启动子上游序列(-410--3)接于HIV-1LTR下游序列(-2-+78)之前,HIV-1Tat蛋白可以激活该杂合启动子表达,说明BIVLTR上游序列可以支持HIV-? 展开更多
关键词 牛免疫缺陷病毒 激活因子 病毒
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抑制子κBα调控激素敏感型单纯性肾病病毒基因反式激活途径中核因子κB活性的研究 被引量:1
8
作者 陶于洪 王峥 +1 位作者 李缠生 朱小石 《四川大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期230-233,共4页
目的研究抑制子κBα基因(IκBα)表达及其对激素敏感型单纯性肾病(SRSNS)病毒基因反式激活途径核因子κB(NF-κB)活性的调控作用。方法采用荧光定量RT-PCR、Western blot和电泳迁移率改变实验分别测定SRSNS活动期、SRSNS缓解期患儿和... 目的研究抑制子κBα基因(IκBα)表达及其对激素敏感型单纯性肾病(SRSNS)病毒基因反式激活途径核因子κB(NF-κB)活性的调控作用。方法采用荧光定量RT-PCR、Western blot和电泳迁移率改变实验分别测定SRSNS活动期、SRSNS缓解期患儿和正常儿童外周血单个核细胞(PBMCs)中IκBα mRNA、蛋白质表达水平和NF-κB活性。同时采用RT-PCR和ELISA分别检测PBMCs呼吸道病毒基因表达和血浆病毒抗体。结果SRSNS活动期PBMCs细胞核中NF-κB活性增加,与SRSNS缓解期和正常儿童比较,差异有统计学意义(P<0.05)。NF-κB活性与呼吸道病毒检出率呈正相关趋势(OR=27,Kappa系数=0.59,P<0.05)。SRSNS活动期PBMCs细胞浆中IκBα蛋白质低于SRSNS缓解期和正常儿童(P<0.05)。SRSNS活动期NF-κB活性与IκBα蛋白质水平呈负相关(r=-0.884,P<0.05)。SRSNS活动期IκBα mRNA水平高于正常儿童,但仍低于SRSNS缓解期(P<0.05)。结论NF-κB介导的病毒基因反式激活过程中存在IκBα异常表达,IκBα对于NF-κB活性具有调控作用。 展开更多
关键词 激素敏感型单纯性肾病抑 制子κBα 因子ΚB 病毒基因激活 呼吸道病毒
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核因子-κB和IL-8在激素敏感型单纯性肾病病毒基因反式激活过程中表达变化及糖皮质激素的影响 被引量:1
9
作者 陶于洪 王峥 +1 位作者 李缠生 朱小石 《四川医学》 CAS 2006年第11期1101-1103,共3页
目的研究激素敏感型单纯性肾病(SRSNS)病毒基因反式激活中核因子-κB(NF-κB)活性和IL-8表达,以及糖皮质激素的抑制作用。方法采用电泳迁移率改变实验、RT-PCR和ELISA分别测定SRSNS活动期(包括初发和复发)患儿外周血单个核细胞(PBMCs)NF... 目的研究激素敏感型单纯性肾病(SRSNS)病毒基因反式激活中核因子-κB(NF-κB)活性和IL-8表达,以及糖皮质激素的抑制作用。方法采用电泳迁移率改变实验、RT-PCR和ELISA分别测定SRSNS活动期(包括初发和复发)患儿外周血单个核细胞(PBMCs)NF-κB活性、呼吸道病毒基因、病毒抗体及IL-8浓度。结果SRSNS活动期NF-κB活性和IL-8水平增加;NF-κB活性与呼吸道病毒检出率呈正相关。SRSNS活动期复发组NF-κB活性和IL-8浓度低于初发组。结论NF-κB和IL-8参与SRSNS病毒基因反式激活。糖皮质激素抑制病毒基因反式激活与其对NF-κB和IL-8的调节作用有关。 展开更多
关键词 肾病综合征 因子-ΚB 病毒基因激活 呼吸道病毒 糖皮质激素
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MHCⅡ类反式激活因子与病毒感染的关系 被引量:5
10
作者 张绪清 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期230-232,共3页
MHCⅡ类反式激活因子(ClassⅡtransactivator,CⅡTA)通过调控细胞是否表达MHCⅡ类分子及其水平而决定宿主是否对外来病毒感染产生免疫应答及其程度,从而影响病毒感染的发生、发展与转归。本文介绍了CⅡTA的结构与功能、IFNγ诱导MHCⅡ... MHCⅡ类反式激活因子(ClassⅡtransactivator,CⅡTA)通过调控细胞是否表达MHCⅡ类分子及其水平而决定宿主是否对外来病毒感染产生免疫应答及其程度,从而影响病毒感染的发生、发展与转归。本文介绍了CⅡTA的结构与功能、IFNγ诱导MHCⅡ类基因表达的机制及CⅡTA分子与病毒间的相互作用。 展开更多
关键词 病毒 MHCⅡ类激活因子 主要组织相容复合物
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激素敏感型单纯性肾病病毒基因反式激活过程中核因子κB活化及IκBα表达研究
11
作者 陶于洪 王峥 +1 位作者 李缠生 朱小石 《现代预防医学》 CAS 北大核心 2007年第2期201-203,共3页
[目的]研究核因子κB(nuclear factor-kappa B alpha,NF-κB)及抑制子κBα(inhibitory kappaB alpha,IκB)α在激素敏感型单纯性肾病(responsive simple nephrotic syndrome,SRSNS)病毒基因反式激活中的作用。[方法]采用电泳迁移率改... [目的]研究核因子κB(nuclear factor-kappa B alpha,NF-κB)及抑制子κBα(inhibitory kappaB alpha,IκB)α在激素敏感型单纯性肾病(responsive simple nephrotic syndrome,SRSNS)病毒基因反式激活中的作用。[方法]采用电泳迁移率改变实验、RT-PCR和ELISA分别测定SRSNS、肾炎性肾病、继发性肾小球疾病、毛细支气管炎和正常儿童外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells PBMCs)中NF-κB活性、呼吸道病毒基因和血浆病毒抗体;实时定量RT-PCR、Western blot和ELISA分别检测SRSNS和正常儿童IκBα基因表达、蛋白质表达和血浆IL-8水平。[结果]与SRSNS缓解期和其他组比较,SRSNS活动期NF-κB活性明显增加。NF-κB活性与呼吸道病毒检出阳性率呈正相关趋势。SRSNS活动期血浆IL-8水平增高,并且与NF-κB活性呈直线正相关关系。SRSNS活动期IκBα蛋白质低于SRSNS缓解期患儿和正常儿童,与NF-κB活性呈直线负相关。而SRSNS活动期IκBαmRNA水平高于正常儿童,但仍低于SRSNS缓解期患儿。[结论]病毒基因反式激活过程中NF-κB活化及IκBα蛋白质表达降低可能是呼吸道病毒触发SRSNS主要机制之一。 展开更多
关键词 激素敏感型单纯性肾病 IΚBΑ 因子-ΚB 病毒基因激活 呼吸道病毒
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腺病毒介导MHC Ⅱ类分子反式激活因子突变体基因治疗小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎
12
作者 龙宪连 管政 +4 位作者 张军 方超平 张薇薇 张倩 沈茜 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期42-47,共6页
目的:观察腺病毒介导MHC Ⅱ类分子(major histocompatibility complex classⅡmolecules)反式激活因子突变体(CⅡTAm)基因治疗小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎(experi mental autoi mmune thyroiditis,EAT)的效果,并探讨其可能的作用机制... 目的:观察腺病毒介导MHC Ⅱ类分子(major histocompatibility complex classⅡmolecules)反式激活因子突变体(CⅡTAm)基因治疗小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎(experi mental autoi mmune thyroiditis,EAT)的效果,并探讨其可能的作用机制。方法:31只健康雌性CBA/J小鼠随机分成EAT模型组(n=8)、CⅡTAm治疗组(n=9)、GFP对照组(n=9)和正常对照组(n=5)。除正常对照组不作特殊处理外,其余3组均以猪甲状腺球蛋白(porcine thyroglobulin,pTg)+弗氏佐剂(com-plete or incomplete Freund adjuvant,CFA/IFA)建立EAT小鼠模型,CⅡTAm治疗组和GFP对照组分别静脉注射重组腺病毒Ad-CMV-CⅡTAm及Ad-GFP进行治疗,EAT模型组注射等量生理盐水。首次免疫后第29日处死小鼠,进行H-E染色观察甲状腺病理形态;免疫组织化学染色测定甲状腺MHCⅡ类分子表达;分析pTg刺激下脾脏淋巴细胞的增殖及其上清液中IFN-γ的分泌水平;ELISA法检测血浆中抗-pTg自身抗体滴度;流式细胞术分析外周血和脾脏淋巴细胞中CD4+T淋巴细胞上可诱导共刺激分子(inducible costi mulator,ICOS)的表达水平。结果:H-E染色结果表明,CⅡTAm治疗组甲状腺淋巴细胞浸润指数(0.3±0.5)低于EAT模型组(1.4±0.4)和GFP对照组(1.5±0.2,P<0.01)。免疫组化结果显示,EAT模型组和GFP对照组甲状腺组织有弥漫性MHC Ⅱ类分子表达,而CⅡTAm治疗组未见明显表达,正常对照组表达呈阴性。80μg/mlpTg刺激下,CⅡTAm治疗组小鼠淋巴细胞刺激指数(SI)明显低于EAT模型组或GFP对照组(P<0.05);培养上清各组IFN-γ分泌水平与SI结果类似(P<0.01)。CⅡTAm治疗组血浆抗-pTg自身抗体滴度显著低于EAT模型组或GFP对照组(P<0.01);CⅡTAm治疗组外周血和脾脏CD4+T细胞ICOS分子阳性表达率亦显著低于EAT模型组或GFP对照组(P<0.01)。结论:重组腺病毒Ad-CMV-CⅡTAm能抑制EAT小鼠甲状腺组织MHCⅡ类分子表达,抑制自身反应性T细胞增殖,减轻甲状腺炎性细胞浸润,降低自身抗体滴度,对EAT有一定的治疗作用。 展开更多
关键词 MHCⅡ类分子激活因子突变体 病毒 自身免疫性甲状腺炎 基因疗法
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牛免疫缺陷病毒反式激活因子功能域的研究
13
作者 荣丽玮 王世珍 +3 位作者 刘淑红 陈启民 耿运琪 C.Wood 《中国病毒学》 CAS CSCD 2000年第1期88-91,共4页
Transactivator (Tat) of bovine immunodeficiency virus (BIV) is a virus encoded regulatory protein, which activates gene expression directed by BIV long terminal repeat (LTR), and plays an important role in BIV replica... Transactivator (Tat) of bovine immunodeficiency virus (BIV) is a virus encoded regulatory protein, which activates gene expression directed by BIV long terminal repeat (LTR), and plays an important role in BIV replicative cycle. With methods of fusion protein expression and deletion mutation, a set of BIV Tat deletion mutants was constructed, and co transfected into FBL cells with BIV LTR. Using luciferase gene as a reporter, the function of BIV Tat mutants was detected and it showed that: 17/96 aa region of BIV Tat peptide contains full activity; auxiliary amino acids exist in N terminal 17/34 aa region; Cys rich region and basic region are essential to BIV Tat activity. Computer prediction of BIV Tat secondary structure was showed, and mechanism how it functions was analyzed. 展开更多
关键词 牛免疫缺陷病毒 激活因子 缺失突变
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乙型肝炎病毒X基因异质性及对其反式激活功能的影响 被引量:38
14
作者 刘妍 董菁 +4 位作者 皇甫竞坤 成军 王琳 王刚 李莉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期125-127,共3页
从慢性乙型肝炎病毒 (HBV)感染患者外周血中扩增X基因序列 ,克隆入pGEM Teasy质粒 ,随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果提示 ,HBV长期携带者体内有HBV准种共存 ,X区内存在热点缺失突变区。为了进一步探讨X区突变对X蛋... 从慢性乙型肝炎病毒 (HBV)感染患者外周血中扩增X基因序列 ,克隆入pGEM Teasy质粒 ,随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果提示 ,HBV长期携带者体内有HBV准种共存 ,X区内存在热点缺失突变区。为了进一步探讨X区突变对X蛋白反式激活功能的影响 ,将野生株及不同缺失突变的X基因片段克隆入pcDNA3 1( )载体的EcoRI位点 ,构建重组表达质粒 ,并分别与报告质粒pSV lacZ共转染HepG2细胞 ,提取细胞裂解液 ,检测SV40启动子调控下的 β 半乳糖苷酶表达活性。共转染结果显示 :野生株X蛋白能够反式激活SV40病毒早期启动子。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 X基因 异质性 激活 HBV
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究 被引量:43
15
作者 刘妍 陆荫英 +3 位作者 成军 王建军 李莉 张玲霞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期40-43,共4页
应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5A蛋白反式激活相关基因。以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(- ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ,制备转染... 应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5A蛋白反式激活相关基因。以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(- ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到 12 1个阳性克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 115个 2 0 0~10 0 0bp的插入片段 ,对其中的 90个片段测序 ,并进行同源性分析 ,显示 31种已知基因编码蛋白和 15种未知功能基因序列 ,包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示 ,成功构建了HCVNS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,该文库的建立为进一步阐明HCVNS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 非结构蛋白NS5A 激活 基因 克隆化
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应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因 被引量:58
16
作者 刘妍 成军 +3 位作者 王刚 李克 段惠娟 李莉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第12期880-883,共4页
应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒 pcDNA3 1( ) core转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1( )为对照 ;制备转染后的细胞裂... 应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒 pcDNA3 1( ) core转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1( )为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,从中提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成 2组 ,分别与 2种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行 2次消减杂交及 2次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果显示 ,成功构建人HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 2 33个白色克隆 ,进行菌落PCR分析 ,其中 2 13个均得到 10 0~ 10 0 0bp插入片段。挑取 6 3个插入片段测序分析 ,其中 6个cDNA片段为未知序列 ,通过生物信息学分析获得其全长序列 ,已被GenBank收录。提示 6个新的cDNA全长序列 ,可能是HCV核心蛋白反式激活靶基因。 展开更多
关键词 核心蛋白质类 激活 消减杂交 丙型肝炎病毒
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活SV40病毒早期启动子的研究 被引量:56
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作者 刘妍 董菁 +6 位作者 成军 钟彦伟 夏小兵 李克 王琳 施双双 段惠娟 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期404-406,共3页
聚合酶链反应 (PCR)扩增HBVX基因 ,克隆至真核表达载体 pVR10 12中 ,构建HBVX基因重组表达载体 pVR10 12 X ;以该质粒转染HepG2细胞 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞X蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pSV lacZ共转染HepG2细胞 ,用试剂盒法... 聚合酶链反应 (PCR)扩增HBVX基因 ,克隆至真核表达载体 pVR10 12中 ,构建HBVX基因重组表达载体 pVR10 12 X ;以该质粒转染HepG2细胞 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞X蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pSV lacZ共转染HepG2细胞 ,用试剂盒法检测 β 半乳糖苷酶表达活性。结果质粒 pVR10 12 X在HepG2细胞瞬时表达X蛋白 ,共转染实验中 pVR10 12 X组 β 半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的 3 2倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达 。 展开更多
关键词 乙肝病毒X基因 真核表达 激活 SV40早期启动子 乙型肝炎
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3与乙型肝炎病毒X蛋白协同反式激活作用的研究 被引量:15
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作者 刘妍 成军 +5 位作者 牟劲松 陆荫英 王建军 杨倩 王琳 张玲霞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期47-49,共3页
构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白 3(NS3)的重组表达质粒pcDNA3 1(- ) NS3和表达乙型肝炎病毒 (HBV)X蛋白的重组质粒pcDNA3 1(- ) X ,分别瞬时转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,用免疫印记 (Westernblotting)方法鉴定病毒基因的表达。... 构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白 3(NS3)的重组表达质粒pcDNA3 1(- ) NS3和表达乙型肝炎病毒 (HBV)X蛋白的重组质粒pcDNA3 1(- ) X ,分别瞬时转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,用免疫印记 (Westernblotting)方法鉴定病毒基因的表达。两个表达质粒分别及同时与报告质粒pCAT3 promoter共转染HepG2细胞 ,检测报告基因氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达水平 ,酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV4 0病毒早期启动子功能的影响。结果显示 ,两个重组表达载体pcDNA3 1(- ) NS3及pcDNA3 1(- ) X在HepG2细胞均能瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白 ;单独共转染实验中 pcDNA3 1(- ) NS3、pcDNA3 1(- ) X组的CAT的表达分别是对照的 3 5倍和 4 4倍 ,两种质粒共同转染时酶的表达是对照的 8 5倍 ;表达质粒对CAT酶表达的激活作用呈剂量依赖性。研究表明 ,HepG2细胞中表达的HCVNS3蛋白和HBVX蛋白均具有反式激活SV4 0早期启动子的功能 ,并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性。本实验有助于解释HCV、HBV感染 ,尤其是共同感染的致病 (癌 ) 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 非结构蛋白 NS3 乙型肝炎病毒 X蛋白 协同激活 研究
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究 被引量:15
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作者 刘妍 成军 +5 位作者 牟劲松 陆荫英 王建军 李克 王琳 张玲霞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期44-46,共3页
聚合酶链反应(PCR)扩增丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3基因 ,克隆至真核表达载体pcDNA3 1(- )中 ,构建HCV NS3基因真核表达载体 pcDNA3 1(- ) NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,免疫印迹方法 (Westernblotting)检测转染... 聚合酶链反应(PCR)扩增丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3基因 ,克隆至真核表达载体pcDNA3 1(- )中 ,构建HCV NS3基因真核表达载体 pcDNA3 1(- ) NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,免疫印迹方法 (Westernblotting)检测转染细胞中HCVNS3蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pCAT3 promoter共转染HepG2细胞 ,用酶联免疫吸附方法 (ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。结果显示 ,质粒pcDNA3 1(- ) NS3在HepG2细胞瞬时表达HCVNS3蛋白 ,共转染实验中pcDNA3 1(- ) NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的 4 6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白 ,并能够反式激活SV4 0病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCVNS3蛋白反式激活的靶基因 。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 非结构蛋白NS3 激活 SV40病毒 早期启动子
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP4的克隆化研究 被引量:7
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作者 刘妍 王春花 +5 位作者 成军 杨倩 王建军 纪冬 党晓燕 张玲霞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期380-382,共3页
目的 筛选并克隆乙型肝炎病毒X蛋白 (HBxAg)反式激活新型靶基因。方法 以HBxAg表达质粒 pcDNA3.1( ) X转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3.1( )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析 ,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进... 目的 筛选并克隆乙型肝炎病毒X蛋白 (HBxAg)反式激活新型靶基因。方法 以HBxAg表达质粒 pcDNA3.1( ) X转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3.1( )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析 ,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3.1( ) X的HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术扩增 ,获得阳性克隆之后 ,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为 348个核苷酸 (nt) ,编码产物由 116个氨基酸残基 (aa)组成 ,并测序证实 ,命名为XTP4 ,在GenBank中注册 ,注册号为AF4 90 2 5 3。结论 通过分子生物学技术与生物信息学技术的结合 ,发现并鉴定、克隆HBxAg反式激活作用的新型靶基因XTP4 。 展开更多
关键词 肝炎病毒 乙型 X蛋白 激活 基因克隆化
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