骨桥蛋白影响矿化液诱导牙髓干细胞成骨分化能力的研究

目的研究骨桥蛋白(osteopontin,OPN)对矿化液诱导牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成骨分化能力的影响,并优化其诱导条件。方法矿化液培养DPSCs作为对照组,在矿化液培养基础上添加适宜浓度OPN作为实验组,在倒置相差显微镜下观察诱导后的DPSCs形态变化;应用茜素红染色法检测矿化结节的形成;采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-RCR)分别检测DPSCs骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx-2)、骨钙蛋白(OCN)、Ⅰ型胶原(Col-1)等骨源性基因表达情况。结果茜素红染色显示诱导培养28 d后两组均出现矿化结节,且实验组的数量和大小明显高于对照组。培养7 d后两组DPSCs骨源性基因表达均成阳性,且实验组中BSP、Runx-2、Col-1及OCN等基因表达水平均明显高于对照组。结论 OPN能增强矿化液诱导DPSCs成骨分化的能力。

Notch信号及自噬在三氧化矿化聚合物促人牙髓细胞体外分化中的作用

目的探讨Notch信号及自噬在三氧化矿化聚合物(mineral trioxide aggregate,MTA)促人牙髓细胞(human dental pulp cells,h DPCs)体外分化的作用。方法体外培养h DPCs,采用荧光定量PCR法检测MTA作用不同时间(24 h、3 d、7 d)对h DPCs碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、核心结合蛋白因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)及牙本质涎磷蛋白(dentin sialophoprotein,DSPP)表达的影响;Von Kossa染色观察细胞钙化结节形成的变化;Western Blot法检测MTA作用下h DPCs Notch信号及自噬相关蛋白表达的变化。结果0.1 mg/m L MTA即可促进体外培养h DPCs的分化。与未处理h DPCs的空白对照组相比,MTA组h DPCs的Notch信号成分Notch1、Hes1、Jagged1及自噬相关蛋白p62表达均明显增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。以自噬体与溶酶体融合抑制剂Bafilomycin A1(BAF)刺激细胞,自噬潮受抑制,Notch1表达升高,MTA具有类似作用。结论 MTA可显著促进h DPCs的体外分化,其作用机制可能与Notch1-Jagged1-Hes1信号转导途径激活及自噬抑制有关。

GLUD1基因对人牙髓干细胞的体外增殖、分化和矿化的影响

目的:探索谷氨酸脱氢酶1(Glutamate dehydrogenase 1,GLUD1)基因在人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,h PDCSs)体外增殖、成骨分化和矿化中的作用。方法:体外分离培养h PDCSs,利用慢病毒感染方式沉默GLUD1基因的表达,分别采用RT-PCR和Western免疫印迹检测mRNA及蛋白水平的沉默效率。采用CCK8法检测细胞的体外增殖水平。对hDPSC进行体外成骨诱导分化培养,采用茜素红染色法检测矿化结节的形成,利用RT-PCR和免疫荧光染色分别检测Runx2、OCN基因的表达。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果:hDPSCs经过成骨诱导分化培养后,GLUD1的表达量较对照组明显上升;hDPSCs经shGLUD1病毒转染后,GLUD1表达明显下调;沉默GLUD1表达的hDPSCs体外增殖能力减弱;经成骨诱导分化培养后,与对照组相比,矿化结节形成明显减少;成骨早期标志基因Runx2上调,成骨晚期标志物OCN在mRNA和蛋白水平均显著下调。结论:沉默GLUD1表达抑制hDPSCs的体外增殖和矿化形成,影响晚期成骨分化;GLUD1在hDPSCs的成骨分化中具有重要作用。

磷酸钙/硅酸钙/泡铋矿复合盖髓材料的细胞毒性和抑菌性评价

目的评价新型复合盖髓材料磷酸钙/硅酸钙/泡铋矿复合水门汀(calcium phosphate-calcium silicate-bismuth compound cement,CPCSBi)的细胞毒性和对常她口腔致龋菌的体外抑菌性能。方法采用琼脂覆盖法,比较CPCSBi和商品化盖髓材料Dycal、氢氧化钙糊剂(calcium hydroxide,CH)对人牙髓细胞的体外细胞毒性作用。采用琼脂扩散法,通过测量抑菌圈直径大小,评价CPCSBi与Dycal、CH对变形链球菌(Streptococcous mutans,Sm)、粘性放线杆菌(Actinomyces viscosus,Av)、嗜酸乳杆菌(Laetobacillus acidophilus,La)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,Sa)及白色念珠菌(Candida albicans,Ca)的抑菌效果。结果CPCSBi表现为轻度细胞毒性,Dycal和CH均显示中度细胞毒性。CPCSBi对Sm、Av、La和Sa具有良好的抑制作用,较Dycal和CH强5～10倍。结论CPCSBi仅有轻微的细胞毒性,但对口腔常见致龋菌的抑菌作用显著,具有进一步开发的潜能。

胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1在人牙髓细胞体外矿化过程中表达的实验研究

目的:研究胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1在人牙髓细胞体外矿化过程中的表达。方法:利用组织块法体外培养人牙髓细胞,实验组培养液中加入矿化诱导剂,对照组不加矿化诱导剂。培养14d后,免疫细胞化学检测牙本质涎蛋白的表达;von kossa染色检测矿化结节的形成。培养期间,采用半定量RT-PCR技术监测LIM矿化蛋白1及碱性磷酸酶的表达,SPSS11.0软件分析结果。结果:培养14d,实验组牙本质涎蛋白免疫细胞化学呈阳性表达,von kossa染色阳性,矿化结节形成;对照组牙本质涎蛋白表达阴性,von kossa染色阴性。RT-PCR结果显示碱性磷酸酶及LIM矿化蛋白1在实验组和对照组各时段均表达。培养期间,实验组LIM矿化蛋白1的表达显著性高于对照组,其中培养第2天及9天时表达分别达到两个高峰,约为对照组的1.8倍及3.0倍。培养期间,碱性磷酸酶的表达显著性增高,其中培养14d时约为对照组的2.0倍。结论:首次发现LIM矿化蛋白1与人牙髓细胞的体外矿化过程相关,提示LIM矿化蛋白1可能在牙髓细胞的分化及矿化中发挥一定作用。

山羊乳牙牙髓细胞分离培养与矿化诱导的体外研究

目的:分离培养山羊乳牙牙髓细胞,研究其矿化诱导前、后生物学特性的改变。方法:采用改良酶解组织块法培养山羊乳牙牙髓细胞,应用免疫组化方法(SAB法)对第2代细胞进行来源检测,经矿化诱导培养的第4代细胞与常规培养细胞做对照,进行相关生物学特性检测,包括细胞增殖能力、矿化能力、细胞形态改变、蛋白OCN表达、相关成骨基因(ALP、COL-I、OCN、OPN)表达水平。结果:改良酶解组织块法可较快地培养出山羊乳牙牙髓细胞,细胞爬出时间为培养的第3～4天。第2代细胞抗波丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性,证明其间充质来源。MTT法测定显示,未诱导细胞的增殖能力明显高于矿化诱导后的细胞。与未诱导细胞相比较,矿化诱导的细胞ALP染色、钙结节茜素红染色均呈强阳性,免疫组化OCN阳性表达。诱导14d后,定时定量PCR检测证实成骨基因OCN、ALP显著上调。结论:本实验采用改良酶解组织块法成功培养出山羊乳牙牙髓细胞;连续矿化诱导培养14d后,山羊乳牙牙髓细胞分泌矿化基质,具有向成骨细胞分化和形成骨组织的潜能。

低浓度β-甘油磷酸钠培养牙髓干细胞向成牙本质细胞分化及相关因子的表达

背景:以往研究用来诱导成牙本质细胞分化的培养基普遍借鉴成骨细胞的诱导浓度,其他浓度的诱导情况尚无相关研究。目的:观察在低浓度β-甘油磷酸钠条件培养下,牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中,牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白和细胞外基质磷酸糖蛋白的表达情况。方法:分离培养人牙髓干细胞,用不同浓度的诱导液诱导牙髓干细胞分别向脂肪细胞,成骨细胞分化,证实其多向分化能力。用5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠诱导培养牙髓干细胞向牙本质细胞分化,分别在培养第7,14,21,28天提取各组细胞RNA,反转录PCR检测牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白和细胞外基质磷酸糖蛋白的表达情况;诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化形成的矿化结节用Alizarin Red S法检测。结果与结论:人牙髓干细胞经过诱导可证实其成功分化为脂肪细胞和成骨细胞;反转录PCR结果显示,5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠培养牙髓干细胞在培养7,14,21 d,各组细胞牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白的mR NA表达增加,伴随细胞外基质磷酸糖蛋白表达下调;培养至28 d,行矿化结节检测发现牙髓干细胞向成牙本质细胞成功矿化,可见红染的矿化结节。结果证实,5 mmol/Lβ-甘油磷酸钠诱导培养的牙髓干细胞可成功分化为成牙本质细胞,并下调细胞外基质磷酸糖蛋白mR NA的表达,同时上调牙本质基质蛋白1及牙本质涎蛋白mR NA的表达。

矿化液对人牙髓干细胞生物学特性的影响

目的探讨矿化液对人牙髓干细胞(DPSCs)生长特性的影响。方法用含一定浓度的β-甘油磷酸钠、抗坏血酸和地塞米松的矿化液诱导人牙髓干细胞,通过倒置相差显微镜、透射电镜、免疫细胞化学染色、vonKossa染色方法,观察和检测矿化液诱导后细胞形态、超微结构、表型和矿化基质分泌的变化,以未诱导组为对照。结果矿化液连续培养7d,人DPSCs细胞形态明显改变,呈牙本质样极化细胞表现,另一侧为增大的胞体;超微结构显示,诱导后的细胞体积增大,核浆比例下降,胞浆细胞器丰富;诱导前细胞不表达牙本质涎磷蛋白(DSPP)和骨钙素(OC),诱导后均表达;连续培养21d,诱导组细胞形成多个矿化结节。结论矿化液能诱导人DPSCs向成牙本质细胞样细胞分化并产生矿化基质。本研究从细胞水平上揭示了人DPSCs向成牙本质细胞分化机理,为人DPSCs应用于牙髓损伤的修复再生提供了依据。

新型复合盖髓材料对人牙髓细胞分化的体外诱导效果

目的研究新型盖髓材料磷酸钙/硅酸钙/泡铋矿复合水门汀(Calcium phosphate-calcium silicate-bismuth compound cement,CPCSBi)诱导牙髓细胞分化的作用。方法分别采用CPCSBi、氢氧化钙(CH)饱和溶液和10%EDTA溶液,从人牙本质粉末中提取可溶性牙本质基质(DDMCs),通过半定量RT-PCR方法,分析不同材料所提取DDMCs对人牙髓细胞的涎磷蛋白(DSPP)、骨钙素(OCN)、转化生长因子-β1(TGF-β1)基因表达的影响。结果不同材料提取的DDMCs都能提高体外培养人牙髓细胞DSPP、OCN和TGF-β1基因的表达,其中以CPCSBi溶液提取DDMCs的促进作用最明显。结论 CPCSBi对牙髓细胞分化具有促进作用。

人牙髓细胞分化过程中DNA甲基胞嘧啶双加氧酶TET家族的表达

背景:DNA甲基胞嘧啶双加氧酶TET家族可将甲基胞嘧啶氧化为羟甲基胞嘧啶,参与机体DNA去甲基化,调控细胞增殖与分化,但其在牙髓细胞中的表达模式仍不清楚。目的:检测TET家族在牙髓细胞成牙本质分化过程中的表达模式。方法:采用酶消化法分离培养人牙髓细胞,细胞免疫荧光法检测TET家族的表达及分布;Western Blot检测TET家族在牙髓细胞传代培养(P1-P7代)中的表达规律;对第3代牙髓细胞矿化诱导7,14 d,qR T-PCR法检测矿化诱导第0,7,14 d的TET家族mR NA水平,Western Blot法检测其蛋白量的表达变化。结果与结论:TET家族在人牙髓细胞的细胞质和细胞核中均有表达。在牙髓细胞体外传代培养过程中,TET1蛋白在P1-P6代随细胞传代呈上升趋势,TET2蛋白在P2和P3代细胞中表达增强(P<0.05),TET3表达量在不同细胞代数之间差异无显著性意义(P>0.05)。细胞经矿化诱导后,TET1,TET2和TET3的mR NA和蛋白表达量均升高(P<0.05)。以上结果提示TET家族可能参与调控牙髓细胞成牙本质分化进程。

lncRNA TUG1对人牙髓干细胞成骨/成牙本质分化的影响

目的探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)牛磺酸上调基因1(taurine upregulated 1,TUG1)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖及成骨/牙本质向分化的影响。方法分离培养hDPSCs,流式细胞术检测细胞表面抗原CD44、CD45、CD73、CD90、CD133、STRO-1,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和茜素红染色鉴定其分化能力。hDPSCs成骨诱导0、7、14 d收集RNA,qRT-PCR检测TUG1的表达水平。构建携带sh-TUG1的慢病毒载体pSLenti-U6-shRNA(TUG1)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE,并通过感染hDPSCs及嘌呤霉素筛选建立稳定沉默TUG1的hDPSCs细胞系,CCK-8检测hDPSCs增殖能力,ALP和茜素红染色及定量检测hDPSCs的早期ALP活性和晚期矿化结节的形成,qRT-PCR和Western blot检测成牙本质及成骨分化相关的基因牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白-1(dentine matrix protein 1,DMP-1)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因及蛋白表达变化。结果成功分离、培养和鉴定hDPSCs,hDPSCs成骨向分化过程中TUG1的表达明显增加(P<0.05)。沉默TUG1后hDPSCs的增殖能力下降(P<0.05),ALP活性降低,矿化结节形成减少;成牙本质分化基因DSPP、DMP-1以及成骨分化基因Runx2、OCN、OPN表达也显著降低(P<0.05)。结论沉默TUG1可抑制hDPSCs的增殖及成骨/成牙本质分化。

血小板浓缩生长因子对人牙髓细胞存活及其增殖分化的影响

目的探讨血小板浓缩生长因子(Concentrate Growth factors,CGF)对人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)增殖分化的影响,为其今后在牙髓及根尖周疾病治疗应用进行前期研究。方法从因正畸治疗拔除的健康恒牙分离培养出人牙髓细胞,在体外采用CGF或矿物三氧化物聚合体(mineral trioxide aggregate,MTA)处理人牙髓细胞,分别在第1、3、7天,CCK-8法测定各组细胞增殖水平、碱性磷酸酶活性、流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果与MTA组相比,CGF组的细胞增殖能力增强,S期细胞的比例增加,且第3、7天ALP活性增高(P<0.05),而第1、7天牙髓细胞凋亡率降低。结论 CGF在体外具有良好的促进牙髓细胞增殖,抗凋亡以及诱导成骨/成牙分化的能力。