RNAi对波动性葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞糖原合成酶激酶-3β、β-联蛋白作用的研究

目的构建糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)特异的RNAi腺病毒表达载体,感染原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),观察其对波动性浓度葡萄糖溶液诱导的HUVEC Wnt信号通路中GSK-3β、β-联蛋白(β-catenin)的影响。方法设计合成针对GSK-3βmRNA不同位点的短发荚RNA(short hairpin RNA,shRNA)编码序列,重组RNAi腺病毒表达载体。实验分为3组,空白对照组、阴性对照组、实验组。空白对照组使用波动性浓度葡萄糖溶液(5.5 mmol/L和30.5 mmol/L两种浓度的葡萄糖溶液每日交替培养,模拟血液中葡萄糖浓度的波动)培养HUVEC;阴性对照组使用波动性浓度葡萄糖溶液培养HUVEC,并使用无携带GSK-3β基因的腺病毒感染培养的HUVEC;实验组使用波动性浓度葡萄糖溶液培养HUVEC,并GSK-3β特异的RNAi腺病毒感染培养的HUVEC。Western印迹法波动性浓度葡萄糖溶液干预前及干预后72小时3组的GSK-3β、β-联蛋白水平。结果波动性浓度葡萄糖溶液干预72小时后,实验组的GSK-3β表达水平(0.1068±0.0034)较空白对照组、阴性对照组低,差异有统计学意义(F=10886.388,P=0.000);实验组的β-联蛋白水平表达水平(0.6653±0.0167)较空白对照组、阴性对照组低,差异有统计学意义(F=315.96,P=0.000)。结论构建的RNAi腺病毒感染HUVEC后可以抑制高糖诱发的GSK-3β蛋白表达、增加细胞内β-联蛋白的蛋白水平。

葡萄糖浓度波动对原代培养的大鼠血管细胞和肾细胞的影响

探讨葡萄糖浓度波动对体外培养的原代大鼠血管细胞和肾细胞的影响。取SD大鼠的主动脉和肾脏进行血管细胞和肾细胞的体外原代培养,每种细胞均分为6组:正常对照组、持续高糖组、持续低糖组、波动组I、波动组II、波动组III。实验24h后,测定细胞乳酸脱氢酶(LDH)的泄漏率,细胞液中的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)的活力,细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力。结果表明葡萄糖浓度波动各组均能对大鼠血管细胞和肾细胞造成损伤,使细胞外液LDH、NAG的泄漏量明显增加,细胞内GSH、SOD活力明显减少,与持续高糖组和持续低糖组比较差异显著(P<0.001)。且葡萄糖浓度波动对肾细胞的损伤比血管细胞更为明显。说明葡萄糖浓度波动能够导致大鼠血管细胞和肾细胞的损伤,并且其损伤远远大于持续高糖或持续低糖的单独作用效果,损伤的结果与低糖作用细胞的时间呈正相关,在相同的损伤条件下肾细胞比血管细胞对葡萄糖浓度波动更为敏感,损伤更为严重。

葡萄糖浓度波动对人肝L02细胞损伤的实验研究

研究了葡萄糖浓度波动对于体外培养的人肝实质L02细胞的影响以及可能的机制.利用人肝实质细胞株L02进行传代培养.实验共分为4组:正常组(N)、持续高糖组(HG)、波动组(GF)和渗透压对照组(OP).各组细胞培养72 h后,测定培养液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)活力,肝细胞内糖原含量,谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化酶歧化酶(SOD)、Na^+K^+-ATP酶和Ca^(2+)Mg^(2+)-ATP酶的活力,胞内游离钙离子([Ca^(2+)]_i)浓度以及细胞膜的流动性.高糖组和波动组细胞培养液中ALT,AST和LDH活力上升,细胞内GSH,SOD,Na^+K^+ATP酶和Ca^(2+)Mg^(2+)-ATP酶活性均下降,MDA和糖原含量上升,细胞膜流动性下降;高糖组和波动组与正常组比较均差异显著(p<0.001),波动组较高糖组也有显著差异(p<0.01).葡萄糖浓度波动能够导致细胞膜通透性的改变和细胞内酶的严重泄漏,同时对肝细胞有明显的氧化损伤和毒性作用,而且比单纯的高糖对肝细胞的损害更为明显和严重.

葡萄糖浓度波动对兔视网膜Müller细胞生长活性和iNOS表达的影响

目的兔视网膜Müller细胞在葡萄糖浓度波动培养下,观察诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、细胞生长活性的表达及变化。方法酶消化法培养兔视网膜Müller细胞,分为4组,正常对照组(N),持续高糖组(HG),葡萄糖浓度波动组(GF),渗透压对照组(OP);四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定各孔光吸收(OD)值。采用免疫荧光染色检测各组细胞iNOS平均荧光强度的改变。结果与N组比较,HG组和GF组OD值下降,iNOS表达升高,均有显著差异(p<0.01);与HG组比,GF组OD值下降(p<0.01),iNOS表达升高,有统计学差异(p<0.05);OP组与N组比较无明显差异(p>0.05)。结论与持续高糖相比Müller细胞在葡萄糖浓度波动时生长活性下降,iNOS表达升高。提示葡萄糖浓度波动在糖尿病视网膜病变发生发展中可能发挥一定的作用。

波动性葡萄糖对胰岛细胞凋亡及PTEN表达的影响

目的:研究细胞凋亡是否与PTEN表达升高相关,并探讨PTEN表达升高是否通过活性氧簇(ROS)进行调控。方法:细胞分为5组:恒定低糖组(L组)、恒定高糖组(H组)、葡萄糖波动组(F组)、高糖后低糖组(HL组)及波动后低糖组(FL组)。检测各组ROS水平、细胞凋亡率、细胞内钙离子浓度、胰岛素水平和PTEN蛋白的表达。结果:F组较H、L组钙离子浓度升高,胰岛素分泌减少,ROS水平升高,PTEN蛋白表达增加,细胞凋亡增多(P<0.05)。HL组较H组钙离子浓度、ROS水平、PTEN蛋白表达和凋亡率有所下降,但仍高于L组(P<0.05)。FL组较F组钙离子浓度、ROS水平、PTEN蛋白表达和凋亡率有所下降,但仍高于低糖组(P<0.05)。结论:波动性葡萄糖较恒定高糖更易导致胰岛细胞凋亡,可能与细胞内钙离子浓度变化,加重氧化应激促进PTEN表达增加有关。葡萄糖浓度恢复可一定程度解除氧化应激,使PTEN表达减少,细胞损伤减轻。

葡萄糖浓度波动对INS-1细胞胰岛素分泌的影响

目的初探葡萄糖浓度波动对大鼠胰岛素瘤INS-1细胞胰岛素分泌功能影响机制。方法将INS-1细胞随机分为正常糖组(5.5 mmol/L葡萄糖培养液培养)、持续高糖组(16.7 mmol/L葡萄糖培养液培养)、波动组(用16.7 mmol/L葡萄糖培养液培养2 h,再换5.5 mmol/L培养3 h,每天重复3次,夜间9 h维持在5.5 mmol/L的培养液中)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)+正常糖组、NAC+持续高糖组、NAC+波动组,后3组的培养基中均预先负载终浓度为1.0 mmol/L的NAC,余干预措施相同,均干预72 h。荧光素酶方法检测细胞内三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)含量,放射免疫分析法测定胰岛素分泌水平。结果 INS-1细胞ATP含量及胰岛素分泌水平在持续高糖组及波动组均较正常糖组显著下降,且波动组下降更明显,差异有高度统计学意义(P<0.01)。NAC+波动组及NAC+持续高糖组细胞ATP含量及胰岛素分泌水平分别较波动组及持续高糖组显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论持续性高糖及波动性高糖损伤INS-1细胞的胰岛素分泌可能与减少细胞ATP含量有关,且波动性高糖较前者更严重,氧化应激可能是波动性高糖及持续性高糖导致INS-1细胞ATP减少的机制。

波动和恒定的葡萄糖浓度对大鼠肾小球系膜细胞TRPC6和TRPC1表达的影响

目的研究波动和恒定的葡萄糖浓度对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(GMC)瞬时受体势TR-PC6和TRPC1表达的影响,探讨糖尿病肾病的发病机制。方法将体外培养的各组系膜细胞分别在波动和恒定葡萄糖浓度中分别培养24、48、72 h后,进行细胞学形态结构观察,MTT法测定细胞存活率,RT-PCR检测细胞TRPC6和TRPC1特异性条带灰度的表达情况。结果波动血糖组在TRPC6基因的表达较恒定高糖组差异有统计学意义(P<0.01)。结论波动葡萄糖浓度对GMC的损伤以及促进细胞凋亡方面较恒定葡糖糖浓度更严重,是导致糖尿病肾病发生和发展的原因之一。

血液葡萄糖水平与HDL亚型变化的相关分析

目的 研究血液葡萄糖（Glu）水平的改变与高密度脂蛋白（HDL）亚型的关系.方法 运用硫酸葡聚糖沉淀法对120例病人（男72例,女48例,年龄在18～93岁）的空腹及餐后标本进行HDL亚型的检测,同时进行空腹葡萄糖（FPG）、餐后2 h葡萄糖（Glu2h）以及包括总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）、载脂蛋白A-I（ApoA-I）、载脂蛋白B（ApoB）、脂蛋白（a） [Lp（a）]的血脂代谢项目检测.分析正常糖耐量对照组（Normal组）,糖尿病组（DM组）,糖调节异常组（IGR组）以及Glu平稳组和波动组之间HDL亚型的变化.结果 ①空腹HDL2-c水平与Glu水平有关,随着Glu水平的逐渐升高,空腹HDL2-c水平逐渐下降,Normal组、IGR组和DM组分别为0.65±0.23,0.55±0.19和0.53±0.18 mmol/L（P=0.01）.②Glu波动组的空腹HDL2-c,HDL2-c/HDL-c（%）水平均低于平稳组,0.54±0.20 mmol/L vs 0.63±0.22 mmol/L,（P＜0.05）;（60.98±10.99）% vs （65.42±9.19%）,（P＜0.05）.性别比较,男性的HDL2-c/HDL-c（%）水平亦存在显著差异,而女性患者则没有.③相关分析显示空腹HDL2-c及HDL3-c均与ApoA-I呈显著正相关（P＜0.01）,r分别为0.742,0.532,餐后亦然.空腹HDL2-c,HDL2-c/HDL3-c及HDL2-c/HDL-c（%）都与Glu2h呈显著负相关（P＜0.05）.④Logistic回归分析显示,Glu的波动与空腹HDL2-c/HDL-c（%）,空腹HDL3-c,ApoA-I水平密切相关（P＜0.05）.其中男性患者的Glu波动与空腹HDL2-c/HDL-c（%）密切相关（P＜0.05）,而女性则与TC,ApoB,Lp（a）,HDL相关（P＜0.05）.结论 血液葡萄糖水平的改变与HDL亚型的变化有关：Glu升高,HDL2水平逐渐下降;餐后Glu越高,表现为HDL颗粒成熟受阻越明显;Glu的波动与空腹HDL2-c/HDL-c（%）,HDL3-c及ApoA-I水平密切相关.

波动性高糖对血管平滑肌细胞增殖及凋亡蛋白表达的影响

目的探讨波动性高葡萄糖对血管平滑肌细胞增殖及凋亡蛋白表达的影响。方法以持续高糖和波动性高糖分别孵育大鼠胸主动脉平滑肌细胞24 h,采用MTT法检测血管平滑肌细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期改变,Western bloting检测胞浆中Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果波动性高浓度葡萄糖(5.5 mmol/L和25mmol/L交替)培养较持续高浓度葡萄糖(25 mmol/L)培养可明显增加血管平滑肌细胞增殖活性,促进其由G0/G1期向S期转变,上调Bcl-2/Bax比值。结论波动性高葡萄糖可能通过干预细胞周期及对凋亡蛋白的调控,进一步促进血管平滑肌细胞增殖,诱导其凋亡,因而较持续性高葡萄糖更能促进糖尿病动脉粥样硬化的发生发展。

扫描式葡萄糖监测在1型糖尿病患者随访管理中的应用

目的评价扫描式葡萄糖监测(FGM)是否改善T1DM患者葡萄糖波动性。方法纳入聊城地区T1DM患者126例,随机分为FGM组(n=65)和自我血糖监测组(SMBG,n=61)。所有患者于第1、24、48周佩戴FGM传感器14 d,FGM组根据动态BG监测图谱进行饮食指导及Ins剂量调整,SMBG组根据空腹及3餐后2 h即时BG监测值进行调整。第50周采集葡萄糖波动水平(IQR)、目标范围内时间(TIR)、平均葡萄糖值(MBG)及低血糖持续时间终点数据进行统计。结果两组基线数值基本一致。24周时SMBG组TIR低于FGM组[(43.3±15.7)%vs(44.8±11.8)%,P<0.05],IQR、MBG及低血糖持续时间高于FGM组[(5.8±1.8)vs(5.2±1.3)mmol/L,(9.8±2.0)vs(9.5±1.2)mmol/L,(257.6±98.4)vs(232.5±72.5)min,P<0.05];48周时SMBG组TIR低于FGM组[(52.4±14.7)%vs(60.9±10.6)%,P<0.05],IQR、MBG及预估HbA1c均高于FGM组[(5.5±1.6)vs(4.7±1.0)mmol/L,(9.5±1.7)vs(8.7±1.2)mmol/L,(8.0±1.6)%vs(7.6±1.1)%,P<0.05]。结论FGM间断应用于T1DM管理,可有效降低BG波动幅度,增加目标范围内时间,减少低血糖发生风险。