基于高效液相色谱法对吸水链霉菌发酵液中波拉霉素A的测定与分离纯化

该研究建立了检测吸水链霉菌(LP-93)发酵液中波拉霉素A含量的HPLC方法,使用C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),确定了流动相[V(乙腈)∶V(水)=45∶55]及相关参数:流速1 mL/min,检测波长220 nm,进样量10μL,柱温30℃。并在此基础上建立了波拉霉素A的高效制备色谱(high performance preparative chromatography,HPPC)分离纯化方法,使用C18色谱柱(250 mm×21.2 mm,7μm),流速15 mL/min,进样量3 mL。进一步使用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometer,UPLC-Q-TOF)对纯化组分进行了定性分析。结果表明,该检测方法在2.5~500 mg/L线性关系良好(R^(2)=0.9998),平均回收率在90.53%~101.96%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)<2%。纯化方法得到较高纯度的波拉霉素A溶液,平均纯度87.52%,平均得率71.84%,并获得波拉霉素A的一级和二级质谱图。该操作方法简便,分析快速,结果准确,可用于吸水链霉菌发酵液中波拉霉素A的含量测定,并为该天然产物的分离纯化提供了参考。

新抗生素波拉霉素 A 和 B 的结构测定

从一株吸水链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＬＰ９３的培养物中分离到新抗真菌抗生素—波拉霉素Ａ和Ｂ。它们属于多羟基大环内酯抗生素。基于光谱数据（ＵＶ，ＩＲ，１ＨＮＭＲ，１３ＣＮＭＲ，ＤＥＰＴ，１Ｈ１ＨＣＯＳＹ，ＨＥＴＣＯＲ，ＨＭＢＣ）波拉霉素Ａ和Ｂ的结构阐明如图１，其中波拉霉素Ａ，Ｒ＝Ｈ；波拉霉素Ｂ，Ｒ＝ＣＨ３。

新抗生素波拉霉素A、B的分离、性质及鉴别

从1株吸水链霉菌StreptomyceshygroscopicusLP－93的培养物中，经溶媒萃取、正相及反相硅胶柱层析、凝胶过滤、制备TLC等方法分离到2个新多羟基大环内配类抗生素．即被拉霉素A和B。波拉霉素具有较强的抗真菌活性，对许多引起植物病害的真菌有较好的抑制活性。波拉霉素A、B均属于多羟基大环内酯类抗生素，但理化性质及结构不同于已知结构的多羟基大林内酯类抗生素。

波拉霉素发酵工艺的优化

目的对吸水链霉菌LP93的发酵培养基及发酵条件进行优化,获得波拉霉素最优发酵条件,为其工业化生产的小型中试发酵工艺提供依据。方法以枯草芽孢杆菌为检定菌株进行波拉霉素发酵液活性测定,以抑菌圈直径为提示指标,通过摇瓶试验确定最优发酵工艺。结果波拉霉素发酵最佳的氮源为黄豆饼粉3.0%+(NH4)2SO4 0.5%、最佳碳源为葡萄糖3.5%、发酵72 h时补加1%葡萄糖和0.5%黄豆饼粉、最终发酵96 h,且豆油和泡敌添加量为0.5%和0.05%时,对波拉霉素发酵无影响。结论为波拉霉素中试发酵条件的确定提供了依据。