EGCG抑制波罗的海希瓦氏菌生物被膜和腐败活性的研究

以海产品腐败菌波罗的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）为对象,评价了儿茶素单体抑制生物被膜的效果,并分析效果最佳的单体对该菌生物被膜和腐败活性的影响.结果表明,5种儿茶素单体均能抑制S. baltica生物被膜形成,其中表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate,EGCG）抑制率最高,其最小抑菌质量浓度为40 μg·mL-1,亚抑菌质量浓度10-30 μg·mL-1的EGCG对细菌生长无显著影响.在30 μg·mL^-1 EGCG作用下,群体感应（Quorum sensing,QS）信号分子呋喃酮酰硼酸二酯（Autoinducer-2,AI-2）、二酮哌嗪类化合物（Diketopiperazine,DKPs）cyclo-（L-Pro-L-Leu）和cyclo-（L-Pro-L-Phe）活性显著下降（P〈0.05）,其抑制率分别为63.95%、27.43%和21.94%.亚抑菌浓度EGCG能显著抑制S. baltica生物被膜形成、泳动能力和蛋白酶活性（P〈0.05）,呈现浓度依赖性,在30 μg·mL^-1时抑制率分别为55.18%,66.71%和46.67%.因此,EGCG在亚抑菌浓度下能够干扰S. baltica的QS系统,有效抑制生物被膜形成,减弱致腐能力,研究为EGCG作为新型的QS抑制剂调控食品腐败菌奠定基础.

大黄鱼来源波罗的海希瓦氏菌SB-19的hfq基因功能分析

为分析大黄鱼来源波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)中分子伴侣Hfq的功能,对具有强致腐能力的波罗的海希瓦氏菌SB-19中hfq基因进行敲除,比较野生株(wide type,WT)和敲除株(knock out,KO)在生长速率、群体感应、抗逆境以及对灭菌鱼汁致腐效果的差异。结果表明:波罗的海希瓦氏菌SB-19中存在1个hfq基因,其基因表达水平随着细胞密度的增加而升高;在30℃培养条件下,WT株和KO株的生长速率接近,但在4℃培养条件下,与WT株相比,KO株的生长出现明显迟滞且稳定期的细胞密度较低;WT株与KO株分泌信号分子的能力相近,但KO株表现出较低的生物被膜形成能力和胞外蛋白酶活性,而且接种KO株的灭菌鱼汁也产生较少的挥发性盐基氮和三甲胺;此外,KO株对盐分、营养、重金属、消毒剂等胁迫条件更为敏感。上述结果表明Hfq参与波罗的海希瓦氏菌SB-19株的多种代谢调控,影响细菌的生长、群体感应、致腐能力、抗逆境能力等,即Hfq是一种全局性调控因子,整体调节波罗的海希瓦氏菌SB-19的诸多生理活动。本实验为波罗的海希瓦氏菌的基础生物学研究和海产品中微生物的致腐机制提供理论基础。

海产品嗜冷菌波罗的海希瓦氏菌中3个冷激蛋白功能分析

【目的】波罗的海希瓦氏菌是冷藏海产品中常见的腐败菌,而该菌中关于冷激蛋白的功能研究尚未见报道。本研究从分子生物学角度分析波罗的海希瓦氏菌中3个冷激蛋白各自的功能。【方法】采用BEAST软件分析γ-变形菌纲中部分食源性微生物的冷激蛋白进化时间,接着利用实时荧光定量PCR方法检测波罗的海希瓦氏菌3个冷激蛋白基因的表达规律,进而构建3个冷激蛋白的基因敲除株,分析敲除株在不同温度和不同环境胁迫条件下的生长状况、群体感应现象以及致腐能力,最后构建3个冷激蛋白的异源表达菌株并分析它们在不同温度和不同环境胁迫条件下的生长状况。【结果】波罗的海希瓦氏菌中鉴定到3个冷激蛋白,分别为cspC、cspD、cspG。所有γ-变形菌纲的cspD基因单独聚成一支,并于1109.6百万年前与其他csp基因相分离,波罗的海希瓦氏菌的cspC和cspG在858.8百万年前互相分开。cspG基因是波罗的海希瓦氏菌低温生存的必需基因,且广泛响应环境胁迫条件;cspC基因对cspG基因功能的实施起辅助作用;cspD不响应冷激,但却会随生长阶段的变化而发生变化。此外,cspC基因和cspG基因在低温条件下与细菌的致腐能力相关。【结论】波罗的海希瓦氏菌3个冷激蛋白基因各有不同,且cspC基因和cspG基因与该菌致腐能力有关,这为今后研究腐败菌的冷适应和致腐机制提供了新思路。

大黄鱼源波罗的海希瓦氏菌致腐性与产生物胺能力研究

为探究波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)产生物胺能力对致腐性的作用,研究测定6株波罗的海希瓦氏菌在灭菌大黄鱼鱼汁4 ℃冷藏条件下挥发性盐基氮(Total volatile basic nitrogen,TVB-N)、三甲胺(Trimethylamine,TMA)生成和生物胺含量,分析其生物胺生成能力与腐败性的相关性,并比较生物胺产生相关基因相对表达量的差异。结果表明,接种于灭菌鱼汁的6株波罗的海希瓦氏菌在4 ℃冷藏5 d生长达到稳定期,并随着冷藏时间的延长接种波罗的海希瓦氏菌的鱼汁中的TVB-N和TMA含量增大;6株波罗的海希瓦氏菌生长和2种胺类代谢产物存在差异,其中菌株S19致腐性最强,菌株S31次之,菌株S12最弱。而且,6株波罗的海希瓦氏菌的产腐胺和尸胺能力也存在差异,其中腐败能力较强的S19和S31还能产生少量的组胺。产腐胺、尸胺与细菌生长、TVB-N和TMA形成呈正相关。此外,强致腐菌S19和S31的产胺基因odc、hdc、torA相对基因表达量高于弱致腐菌。可见,波罗的海希瓦氏菌的生物胺生成能力与腐败能力密切相关,腐败能力越强其产生物胺能力越强。研究结果可为大黄鱼保鲜和生物胺的控制提供理论支持。

基于比较基因组学分析大黄鱼来源波罗的海希瓦氏菌的防御系统

【目的】波罗的海希瓦氏菌是冷藏海产品中常见的腐败菌,通过全基因组测序和转录组测序,分析它们的规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统和限制修饰(restricted modification,R-M)系统,为波罗的海希瓦氏菌的基础生物学研究和海产品中微生物的致腐机制提供理论基础。【方法】分析大黄鱼来源波罗的海希瓦氏菌SB-19株和W-3株的致腐能力,对W-3株的全基因组序列进行测序、组装和注释,结合已报道的SB-19株和27株希瓦氏菌的全基因组序列,采用比较基因组学方法探究它们的CRISPR和R-M系统的差异,进而对SB-19株和W-3株在不同生长时期进行转录组测序,以及两株菌内致腐相关基因的共进化分析。【结果】灭菌大黄鱼汁中产生挥发性盐基总氮和三甲胺值显示波罗的海希瓦氏菌SB-19株和W-3株分别为强致腐能力和弱致腐能力菌株;平均核苷酸一致性证实SB-19株和W-3株为波罗的海希瓦氏菌,但基于全基因组构建的系统发育树则发现二者之间存在遗传信息上的差异;SB-19株具有相对完善的CRISPR系统,而W-3株则有更丰富的R-M系统;转录组测序反映出SB-19株在对数期和平台期的生长阶段具有更为活跃的新陈代谢能力和环境适应能力;但是这2株细菌中与致腐相关基因在进化过程中较为保守。【结论】CRISPR系统和R-M系统为异养型的波罗的海希瓦氏菌提供了较好的异源遗传信息入侵屏障,在维持物种遗传稳定性方面发挥了重要作用,但不参与该菌致腐能力差异的进化过程。

Shewanella baltica luxR基因缺失菌株的构建及其功能初步研究

细菌的luxR基因作为群体感应信号分子受体蛋白的编码基因,在细菌的群体感应及其调控的功能中发挥着重要作用。为探究冷藏凡纳滨对虾特定腐败菌波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)(WT SA03)的群体感应现象,采用PCR融合和同源重组法构建了S.baltica的luxR基因缺失菌株(ΔluxR WT SA03),对比研究了luxR基因缺失后WT SA03的生长、产硫能力及蛋白表达的差异。结果表明,经PCR扩增融合后的重组质粒在大肠杆菌中成功表达,并通过接合反应将质粒从大肠杆菌转移到野生型S.baltica WT SA03中,构建了S.baltica的luxR基因缺失株。进一步研究表明,S.baltica的luxR基因缺失对其生长并无影响,但luxR基因对其产硫能力影响显著。表明luxR基因与WT SA03的致腐能力密切相关。研究结果为深入解析S.baltica的luxR基因功能及其调控的细菌群体感应与致腐机制提供了基础。