MO7e细胞增殖法检测注射用重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白生物活性方法的建立和验证

目的:建立并验证用于检测注射用重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白(recombinant human thrombopoietin mimetic peptide-Fc fusion protein,TMP-Fc)生物活性的MO7e细胞增殖法,用于TMP-Fc的质量控制。方法:以人巨核细胞白血病细胞株MO7e作为基质细胞,不同浓度的TMP-Fc与MO7e细胞作用,与其表面血小板生成素(thrombopoietin,TPO)受体结合,刺激细胞增殖,通过比色法测定细胞增殖情况来评价TMP-Fc的生物学活性,其结果用质控参考品进行校正。从显色方法、作用时间、TMP-Fc稀释率等多个方面对实验条件进行优化。对方法的专属性、线性与范围、准确度及精密度进行验证。结果:MO7e细胞对TMP-Fc有很好的剂量反应关系,方法专属性良好;线性范围为0.006 4～2 500 ng·m L-1,相关系数≥0.99;回收率在80%～120%之间。3批原研品和3批TMP-Fc经3次重复测定,其RSD均在15%之内,说明方法精密度良好;其活性分别为(193 152±6 799)～(219 187±11 390)U·mg-1和(207 822±30 423)～(228 549±15 865)U·mg-1,采用One-way ANOVA统计分析,组间P值大于0.05,说明TMP-Fc生物学活性与原研品相似。结论:建立并验证测定TMP-Fc生物活性的MO7e细胞增殖法,该方法具有较好的专属性、准确度和精密度,可用于TMP-Fc的生物学活性评价和质量控制。

重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白抗体中和活性检测方法的建立

目的:建立重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白(TMP-Fc)抗体中和活性的检测方法,并应用于免疫原性研究中的样品分析。方法:基于MO7e细胞依赖于TMP-Fc增殖的活性检测方法,以及TMP-Fc的阳性中和抗体对MO7e细胞增殖的抑制作用,建立TMP-Fc抗体中和活性检测方法。结果:TMP-Fc对MO7e细胞的增殖具有促进作用,在3.2~80 ng/m L浓度范围内作用显著;阳性血清稀释率低于1/10 000时,对MO7e细胞的增殖有明显抑制作用;检测方法经优化,确定最佳血清稀释率为1/20,最佳药物浓度为16 ng/m L;实验阈值(CP)确定为23.78%。免疫原性结果显示,TMP-Fc与罗米司亭在300μg/kg剂量下中和抗体个体发生率分别为30%和40%,表明二者在免疫原性方面类似。结论:建立了一种TMP-Fc抗体中和活性检测方法,并应用于免疫原性研究的样品分析,为TMP-Fc在长期毒性实验中的免疫原性评价提供了有效的检测手段。