改良Blue Native PAGE方法的建立及对注射用A型肉毒毒素活性药用成分天然结构的分析

建立具有较高分辨率的温和的Blue native PAGE方法,用于分析国产注射用A型肉毒毒素(商品名为衡力■)复合物活性药用成分(Pharmaceutical active ingredient,API)天然结构。通过改进样品处理方法解决蛋白样品分解的问题。由7种电极缓冲液构成8个组合,从中筛选出最优组合并改进染色方法,电泳结果的分辨率明显提高。以基于改良Blue native PAGE进行二维SDS-PAGE,以基于二维电泳的Western blotting对各组分定性分析,以改良对Blue Native PAGE对A型肉毒毒素API天然结构相对分子质量进行测定。改良Blue Native PAGE方法能够分析注射用A型肉毒毒素API天然结构,明确了注射用A型肉毒毒素API天然结构的存在形态及组成,注射用A型肉毒毒素API相对分子质量为(918±18. 38) k。

注射用A型肉毒毒素的稳定性验证

目的验证注射用A型肉毒毒素(商品名:衡力)成品的稳定性。方法依据《中华人民共和国药典》2010版(三部)(简称《中国药典》)各论中注射用A型肉毒毒素成品检定标准,对注射用A型肉毒毒素成品进行稳定性长期试验(2~8℃)、加速试验(25±2)℃、高温试验(35±2)℃;同时监测在低温(-5^-20℃)冻存条件下药品到有效期终点时的质量稳定性数据及复溶后的质量稳定性数据;采用趋势分析和批内批间变异系数分析药品的稳定性。结果该药品在3年有效期内(2~8℃)保存,各项质量指标的检测结果均符合要求,批内、批间一致性亦符合要求;在室温保存条件(25±2)℃,6个月和高温(35±2)℃,15 d情况下,药品的各项质量指标同样符合《中国药典》的标准。药品在低温冻存(-5^-20℃)条件下至有效期终点,其关键质量指标均符合标准。药品复溶后在2~8℃保存6 d,其效价持续稳定,无菌检查合格。结论注射用A型肉毒毒素在≤8℃条件下保存的有效期为3年,在室温连续保存期限为6个月,高温条件连续保存时限为15 d。药品复溶后在2~8℃无菌条件可保存6 d。

肉毒杆菌毒素制剂 关键词：呼吸衰竭及死亡

美国FDA于日前颁发公告，Botox和Cosmetic（活性成分Botulinum toxin TypeA，A型肉毒杆菌毒素），Myobloc（活性成分Botulinum toxin Type B，B型肉毒杆菌毒素）与某些不良反应事件有牵连，包括有多种病症以这些药品广范围剂量治疗后呼吸衰竭和死亡。

注射用A型肉毒毒素的生物学特性及质量分析

目的对注射用A型肉毒毒素(Botulinum toxin type A for injection,商品名衡力,出口商品名BTXA)制品中的活性药用成分(Active pharmaceutical ingredient,API)的性质及2009～2011年生产的注射用A型肉毒毒素原液的比活性进行分析。方法对BTXA收获物样品进行阴离子交换层析,分离毒素复合体各组分;采用血凝试验、HPLC法、SDS-PAGE、等点聚焦电泳及N-末端氨基酸测序等方法分析A型肉毒毒素复合体及其各组分的性质;统计2009～2011年连续生产的注射用A型肉毒毒素原液的比活性数据,分析连续生产的工艺稳定性和质量重现性。结果 BTXA收获物样品在碱性条件下可被解离,解离出的A型肉毒神经毒素相对分子质量约为150 000,无血凝效价;BTXA的API为完整的单体,纯度均在99.5%以上;复合物和神经毒素的等电点分别为4.97、4.91,N-末端氨基酸测序结果与GenBank基本一致;在连续3年的生产过程中,原液比活性平均为3.0×107LD50/mg蛋白,BTXA成品中API载量约为5 ng/瓶。结论注射用A型肉毒毒素的活性成分是特异的复合体结构,可在碱性条件下解离出A型肉毒神经毒素;BTXA原液的比活性在连续3年的生产中持续稳定,具备很好的连续性,为临床使用的安全性提供依据。