雾水葛提取物抑制脂多糖诱导的人泪腺上皮细胞炎症反应的实验研究

目的 观察雾水葛提取物对人泪腺上皮细胞活力和炎症的影响,鉴定活性单体并探索药理机制。方法 选取宁波市眼科医院收治的一位25岁女性泪腺炎患者,分离培养其人泪腺上皮细胞,免疫荧光法检测细胞标志物表达以鉴定细胞,不同剂量脂多糖(LPS)诱导细胞炎症反应,四甲基偶氮唑盐比色(MTT)检测细胞活力筛选LPS最佳剂量。使用水、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分别提取雾水葛活性成分,MTT法检测不同溶剂和剂量雾水葛提取物对人泪腺上皮细胞活力的影响。通过电喷雾质谱和核磁共振谱图确定氯仿提取物中活性成分的结构,将鉴定得到的5种化合物(LF1~5)进行药物靶标的预测,Western Blot法检测5种化合物的雾水葛提取物对人泪腺上皮细胞炎症相关蛋白表达的影响。结果 (1)细胞鉴定:角蛋白(CK)14、CK7、E-钙黏蛋白(E-cadherin)等阳性表达确定得到的是人泪腺上皮细胞和少量肌上皮细胞。(2)剂量筛选:处理48 h和72 h后,当LPS浓度为80 mg/L时,细胞活力开始低于对照组,差异有统计学意义(t_(48 h)=6.827、t_(72 h)=6.222,均P=0.002),故LPS浓度80 mg/L、处理时间为24 h为最佳诱导方法。高浓度下,不同雾水葛提取物都具有对细胞活力的抑制作用,2.5、5、10、20μg/mL为提取物的适宜浓度。(3)雾水葛氯仿提取物中物质鉴定:LF-1为(-)-Epicatechin,LF-2为8-(2-Pyrrolidinone-5-yl)-(-)-epicatechin,LF-4为3’-Demethylicariside E3,LF-3、LF-5为首次发现。(4)药物靶标筛选:5种氯仿提取物中,一共有5个共同靶点,分别为花生四烯酸5-氧化酶活化蛋白(ALOX5)、白细胞介素(IL)-2、IL-6、核因子κB1(NF-κB1)和血管内皮生长因子A(VEGFA)。(5)炎症相关蛋白:5种雾水葛的氯仿提取物都能不同程度地抑制炎症相关蛋白的水平,其中以LF-3的抑制效果最佳。结论 雾水葛提取物能够抑制LPS诱导的人泪腺上皮细胞的炎症反应,其中以氯仿提取物中的LF-3成分的药理活性最佳。

miR-199a-3p通过靶向VEGFA缓解H_(2)O_(2)诱导泪腺上皮细胞损伤

目的观察miR-199a-3p、血管内皮生长因子(VEGF)A对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导泪腺上皮细胞氧化应激、凋亡的作用并探究二者之间的关系。方法通过H_(2)O_(2)诱导泪腺上皮细胞损伤模型。将泪腺上皮细胞随机分为对照组(不做任何处理)、H_(2)O_(2)组(200μmol/L)H_(2)O_(2)+anti-miR-con组(转染anti-miR-con)、H_(2)O_(2)+anti-miR-199a-3p组(转染anti-miR-199a-3p)、H_(2)O_(2)+pcDNA组(转染pcDNA)、H_(2)O_(2)+pcDNA-VEGFA组(转染pcDNA-VEGFA)、H_(2)O_(2)+anti-miR-199a-3p+si-con组(共转染anti-miR-199a-3p和si-con)、H_(2)O_(2)+anti-miR-199a-3p+si-VEGFA组(共转染anti-miR-199a-3p和si-VEGFA),除对照组及H_(2)O_(2)组外,剩余组转染泪腺上皮细胞,再用H_(2)O_(2)处理2 h。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞miR-199a-3p、VEGFA表达;Western印迹法检测细胞VEGFA、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达;免疫荧光法检测细胞活性氧(ROS)含量;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果在H_(2)O_(2)的诱导下,泪腺上皮细胞中miR-199a-3p表达显著升高,而VEGFA表达显著下降(均P<0.05)。敲除miR-199a-3p表达可以降低H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞中ROS、MDA、Bax表达,促进GSH、Bcl-2表达,降低细胞的凋亡水平,差异显著(均P<0.05)。Starbase预测miR-199a-3p与VEGFA的3′非翻译区(UTR)端存在6个连续的结合位点,且miR-199a-3p明显抑制野生型VEGFA的荧光活性,并负向调控VEGFA蛋白表达(均P<0.05)。过表达VEGFA蛋白可降低H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞中ROS、MDA、Bax表达,促进GSH、Bcl-2表达,降低细胞的凋亡水平,差异显著(均P<0.05)。同时敲低miR-199a-3p和VEGFA,H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞中ROS、MDA、Bax表达显著增加,GSH、Bcl-2表达显著降低,且凋亡水平显著增加(均P<0.05)结论miR-199a-3p促进H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞氧化应激和凋亡,其机制与靶向调控VEGFA有关。

雌二醇及丙酸睾酮对H2O2诱导泪腺上皮细胞凋亡的抑制作用

背景性激素在干眼症的发病过程中起着重要的作用，尤其是对泪腺的功能起到非常重要的调控作用，但其对泪腺上皮细胞凋亡作用的机制尚不完全明确。目的探讨雌二醇及丙酸睾酮对H2O2诱导的兔泪腺上皮细胞的凋亡作用。方法分离2～3月龄雄性普通级新西兰兔的泪腺组织，用组织块培养法体外培养兔泪腺上皮细胞，用细胞角蛋白（CK）抗体对培养的细胞进行免疫细胞化学鉴定。取对数生长期的细胞，以5×10^-5个／ml接种于96孔板培养44h后，培养基中分别加入1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8mol／L的雌二醇或丙酸睾酮培养24h，再加入1×10^-4 mol／L H2O2培养1h诱导细胞凋亡，仅用H2O2作用的细胞作为凋亡对照组，常规培养的细胞作为空白对照组。MTT比色法检测各组细胞570nm处泪腺上皮细胞活性的吸光度（A570）值，流式细胞仪Annexin V／PI双染法检测各组细胞的凋亡情况。结果培养的细胞呈不规则多边形，其中80％以上的细胞对CK呈阳性反应。MTT比色法检测表明，与空白对照组比较，凋亡对照组、不同浓度雌二醇组和丙酸睾酮组的A。值均明显降低，差异均有统计学意义（P〈0．01），1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7mol／L雌二醇组和1×10^-6mol／L丙酸睾酮组的A570值均明显高于凋亡对照组，差异均有统计学意义（P〈0．01）。与相应浓度丙酸睾酮组相比，雌二醇组A570值均明显增高，差异均有统计学意义（P〈0．01）。与凋亡对照组比较，丙酸睾酮组和雌二醇组早期及晚期细胞凋亡率均明显下降，差异均有统计学意义（P〈0．01，P〈0．05）；与丙酸睾酮组相比，雌二醇组早期及晚期的细胞凋亡率明显下降，差异均有统计学意义（P〈0．01，P〈0．05）。结论雌二醇及丙酸睾酮可抑制H2O2诱导的泪腺上皮细胞的凋亡，雌二醇的抑制作用强于丙酸睾酮。雌二醇对泪腺上皮细胞凋亡的抑制作用呈一定的剂量依赖性。

Ⅱ型胶原酶体外分离大鼠泪腺上皮细胞及细胞培养

目的探求体外分离及培养大鼠泪腺上皮细胞的最佳方法。方法用Ⅱ型胶原酶消化的方法分离泪腺上皮细胞。DMEM/F12作为培养基,辅加表皮生长因子和地塞米松,体外培养泪腺上皮细胞。结果用Ⅱ型胶原酶消化的方法获得了较纯的泪腺上皮细胞。36h后可见细胞大部分已贴壁。72h后细胞开始伸展,生长较活跃。10d后细胞基本融合。结论用Ⅱ型胶原酶消化的方法可得到较纯的泪腺上皮细胞;表皮生长因子联合地塞米松可加快细胞的生长速度。

大鼠泪腺上皮细胞的原代培养和鉴定

目的从大鼠泪腺组织分离泪腺上皮细胞并鉴定。方法采用胶原酶Ⅰ、透明质酸酶和DNA酶混合消化法分离细胞,并对泪腺上皮细胞进行纯化和鉴定。采用胶原预包被培养瓶,并在培养基中添加霍乱毒素(cholera toxin,CT)维持上皮细胞形态。采用细胞免疫荧光染色方法对培养的泪腺细胞主要标志物进行鉴定,包括上皮细胞标志物细胞角蛋白(cytokeratin,CK)和E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-Cad),间充质细胞标志蛋白波形蛋白(vimentin,Vim),肌上皮细胞标志蛋白α-SMA和S100蛋白。结果原代培养的泪腺上皮细胞在3天内贴附到瓶底上,并增殖形成汇合的单层细胞。泪腺上皮细胞表现出鹅卵石形态,并混有少量梭形细胞。分离培养的细胞高表达CK和E-Cad,弱表达α-SMA和S100蛋白,基本不表达Vim。结论本研究成功建立了大鼠泪腺上皮细胞的原代培养方法,为泪腺疾病尤其是干眼病和干燥综合征的研究提供了一种稳定经济的体外模型。

淫羊藿总黄酮含药血浆对干眼症泪腺上皮细胞模型IL-6表达的影响

目的研究淫羊藿总黄酮含药血浆对干眼症泪腺上皮细胞模型中IL-6表达的影响。方法取健康1月龄雄性新西兰大耳白兔61只,按随机的方法取1只雄兔泪腺,用于培养泪腺上皮细胞,取第3代泪腺上皮细胞用于实验。按随机的方法将60只雄兔分为空白组、淫羊藿总黄酮2.5倍组、淫羊藿总黄酮5倍组以及淫羊藿总黄酮10倍组。利用MTT法决定后面干预细胞含药血浆的浓度。将生长良好的泪腺上皮细胞,随机分成空白组、淫羊藿总黄酮组和雄激素组,分别添加空白血浆、淫羊藿总黄酮血浆、丙酸睾酮进行干预。干预48 h后,再分别加入H2O2继续培养1 h,以建立干眼症细胞模型。通过H2O2诱导雄兔泪腺上皮细胞凋亡,以建立干眼症细胞凋亡模型。用流式细胞术检测各组IL-6的表达。结果根据MTT实验结果选取干预细胞含药血浆的浓度为淫羊藿总黄酮2.5倍组。空白组中IL-6的表达均高于雄激素组、淫羊藿总黄酮组,差异具有统计学意义(P <0.05)。雄激素组中IL-6的表达均高于淫羊藿总黄酮组,差异具有统计学意义(P <0.05)。结论淫羊藿总黄酮含药血浆作用于干眼症泪腺上皮细胞模型中可抑制IL-6表达,从而使IL-6的表达下调。含淫羊藿总黄酮含药血浆可能是抑制IL-6表达途径从而达到抑制炎症作用,这可能是它治疗干眼症的关键机理之一。

毛果芸香碱促进培养的兔泪腺上皮细胞蛋白合成和分泌

目的研究毛果芸香碱对体外培养兔泪腺上皮细胞蛋白分泌与合成的影响。设计实验研究。研究对象培养的兔泪腺上皮细胞。方法对培养细胞进行广谱细胞角蛋白、波形蛋白免疫组化染色及电镜观察鉴定后,培养的兔泪腺上皮细胞中,分别加入700、70、7、0.7和0.07μmol/L的毛果芸香碱,培养24小时,分别测定培养液和细胞中的β-氨基已糖苷酶活性。在不同浓度毛果芸香碱的培养细胞中加入70μmol/L阿托品,培养24小时,分别测定培养液和细胞中的β-氨基已糖苷酶活性。主要指标β-氨基已糖苷酶活性(光密度值,OD)。结果毛果芸香碱在700、70、7、0.7和0.07μmol/L浓度时使泪腺上皮细胞培养液β-氨基已糖苷酶活性OD值分别增加17.7%(P=0.015)、14.7%(P=0.038)、5.7%(P=0.399)、4.3%(P=0.517)和2.0%(P=0.764),使泪腺上皮细胞冻融液β-氨基已糖苷酶活性OD值分别增加25.0%(P=0.000)、16.8%(P=0.001)、10.6%(P=0.023)、7.6%(P=0.089)和4.8% (P=0.271)。阿托品抑制毛果芸香碱的作用,使泪腺上皮细胞培养液β-氨基已糖苷酶活性OD值分别减少20.5%(P=0.018)、15.1%(P=0.029)、10.1%(P=0.097)、11.5%(P=0.118)和7.9%(P=0.085),使泪腺上皮细胞冻融液β-氨基已糖苷酶活性OD值分别减少10.0%(P=0.039)、4.8%(P=0.113)、6.2%(P=0.162)、2.9%(P=0.315)和0%(P=0.300)。结论毛果芸香碱可增加培养的泪腺上皮细胞的蛋白分泌和合成,阿托品可抑制毛果芸香碱的作用。

密蒙花总黄酮含药血浆干预干眼症细胞凋亡模型AR mRNA表达

目的:探讨密蒙花总黄酮含药血浆对雄激素水平下降所致干眼症的细胞凋亡模型ARmRNA表达的影响,并应用雄激素受体阻滞剂以确定ARmRNA表达与密蒙花总黄酮含药血浆和AR受体的结合效应有关。方法:体外分离及培养泪腺上皮细胞,以H2O2诱导大鼠泪腺上皮细胞凋亡,建立雄激素水平下降所致干眼症的细胞凋亡模型。设立空白血浆组、密蒙花总黄酮含药血浆组、丙酸睾酮组,分别观察各组ARmRNA表达情况;并应用雄激素受体阻滞剂氟他胺,观察密蒙花总黄酮的拟雄激素效应。结果:密蒙花总黄酮含药血浆干预组与丙酸睾酮干预组中ARmRNA的表达增强,两组间的差异有显著性(P<0.05)。各组加入雄激素受体阻滞剂后,组间的ARmRNA表达无差异(P>0.05)。结论:密蒙花总黄酮含药血浆可促进ARmRNA表达,产生与丙酸睾酮相同的雄激素效应。ARmRNA的表达与密蒙花总黄酮含药血浆和AR受体的结合效应有关。

密蒙花总黄酮含药血浆干预干眼症细胞凋亡模型STAT1磷酸化蛋白表达(英文)

目的:探讨密蒙花总黄酮含药血浆和雄激素受体阻滞剂对泪腺上皮细胞中STAT1的磷酸化蛋白表达的影响。方法:体外分离及培养泪腺上皮细胞。以H2O2诱导大鼠泪腺上皮细胞凋亡,建立雄激素水平下降所致干眼症的细胞凋亡状态。设立空白血浆组、密蒙花总黄酮含药血浆干预组、丙酸睾酮干预组,分别观察各组STAT1的磷酸化蛋白表达情况;并应用雄激素受体阻滞剂氟他胺,考察密蒙花总黄酮的拟雄激素效应。结果:免疫印迹结果表明,含药血浆干预后,密蒙花总黄酮含药血浆干预组中(0.353±0.494)与丙酸睾酮干预组中STAT1的磷酸化蛋白(0.502±0.036)的表达增强,两组间的差异有统计学意义(P<0.01)。各组加入雄激素受体阻滞剂后,各组间(分别是0.268±0.061,0.283±0.106,0.213±0.071)的STAT1的磷酸化蛋白表达间无差异。结论:密蒙花总黄酮含药血浆可促进STAT1的磷酸化表达,并激活STAT1细胞信号传导通路,而产生与丙酸睾酮相同的雄激素效应。

泪腺作为潜在人免疫缺陷病毒储存库的分子机制研究

背景获得性免疫缺陷综合征（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的以全身免疫系统严重损害为特征的感染性疾病，目前主要的治疗方法是高效抗逆转录病毒疗法（HAART），但不能彻底清除患者体内的免疫缺陷病毒（HIV），目前认为是病毒潜伏于HIV储存库所致。研究证实HAART治疗后患者血浆中HIV载量检测阴性的AIDS患者的泪液中发现了HIV，因此探索其眼部储存库是非常重要的。目的探讨泪腺组织是否具有HIV储存库的分子基础以及HIV感染泪腺组织的发生机制。方法收集2013年11月至2015年12月在北京协和医院因泪腺良性疾病行泪腺手术获得的泪腺组织标本14例，其中13例来自于HIV阴性患者，1例来自于HIV阳性患者。13例HIV阴性患者临床诊断为泪腺脱垂者9例和泪腺炎者4例，病理诊断为正常泪腺组织者12例和泪腺间质淋巴组织增生者1例。HIV阳性患者的临床诊断为泪腺炎，病理诊断为泪腺间质淋巴组织增生。将12例HIV阴性和1例HIV阳性患者的泪腺组织标本用石蜡固定切片，采用免疫组织化学法检测泪腺标本中HIV受体CD4及CXC趋化因子受体4（CXCR4）和CC趋化因子受体5（CCR5）分子的表达；1例HIV阴性患者的泪腺组织标本制备成新鲜冰冻切片，采用免疫荧光染色对泪腺标本中CD4及CXCR4和CCR5分子的表达进行验证。结果免疫组织化学染色显示，HIV阴性患者泪腺组织CD4分子染色背景强，为可疑阳性表达；各例标本中多数泪腺上皮细胞可见CXCR4表达，定位于细胞质和细胞核，少数泪腺上皮细胞不表达CXCR4；在各例标本中少数泪腺上皮细胞中CCR5呈局灶阳性表达，主要位于细胞质和细胞核，多数泪腺上皮细胞不表达CCR5。HIV阳性患者泪腺组织中CD4分子染色背景强，为可疑阳性表达；CXCR4及CCR5在泪腺上皮细胞中为阳性表达；间质组织中可见大量散在淋巴细胞，其CD4、CXCR4及CCR5均为阳性表达。免疫荧光染色显示，HIV阴性患者泪腺组织中CD4、CXCR4、CCR5均呈红色荧光，CD4呈线状及片状分布，主要定位于泪腺上皮细胞的细胞膜，而CXCR4和CCR5则呈现散在点状分布，定位于泪腺上皮细胞的细胞质。结论HIV相关分子受体CD4及其辅助受体CXCR4、CCR5在泪腺上皮细胞均呈阳性表达，泪腺上皮细胞具有受到HIV感染和成为HIV储存库的分子基础。

菊花总黄酮含药血浆对干眼症细胞模型Bax mRNA及Bcl-2mRNA表达的影响

目的观察菊花总黄酮含药血浆对大鼠泪腺上皮细胞干眼症模型中Bax mRNA及Bcl-2 mRNA表达的影响。方法将培养生长状态良好的大鼠泪腺上皮细胞随机分为无雄激素培养组(空白组)、雄激素培养组(雄激素组)、无雄激素培养黄酮组(菊花总黄酮组),分别加入空白血浆、丙酸睾酮、菊花总黄酮含药血浆干预48 h,然后加入100μmol/L H_2O_2继续培养60 min诱导细胞凋亡。RT-PCR法检测泪腺上皮细胞中Bax mRNA及Bcl-2 mRNA的表达情况。结果雄激素组和菊花总黄酮组Bax mRNA表达量均明显低于空白组(P均<0.05),Bcl-2 mRNA表达量均明显高于空白组(P均<0.05),雄激素组和菊花总黄酮组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论菊花总黄酮含药血浆有可能通过抑制泪腺上皮细胞中Bax mRNA表达及促进Bcl-2 mRNA表达的途径,起到抑制泪腺上皮细胞凋亡的作用。

菊花总黄酮含药血清对干眼细胞模型AR、NF-κB磷酸化蛋白及TGF-β1表达的影响

目的观察菊花总黄酮在体外条件下对泪腺上皮细胞中雄激素受体(Androgen Receptor,AR)的调控作用及对下游的核因子κB(Nuclear Factor kappa B,NF-κB)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)的表达影响。方法以过氧化氢(H2O2)诱导泪腺上皮细胞凋亡,建立细胞模型,设立无雄激素培养空白对照组、含雄激素培养对照组、无雄激素培养黄酮治疗组。以MTT法摸索含药血清最佳干预加入量;免疫印迹实验(Western Blot)以及实时荧光定量PCR法(Quantitative Real-Time PCR,qPCR)检测泪腺上皮细胞中AR、NF-κB及TGF-β1的表达情况;并应用雄激素受体阻断剂氟他胺进行AR阻断后再次检测上述指标。结果MTT法检测后计算得出含药血清干预细胞的最终浓度为13.2%;无雄激素培养黄酮治疗组及含雄激素培养对照组中AR、NF-κB及TGF-β1的表达增强,与空白对照组对比有显著差异(P<0.01);无雄激素培养黄酮治疗组中NF-κB表达量比含雄激素培养对照组表达量低,两者间的差异有统计学意义。氟他胺及含药血清干预后,无雄激素培养黄酮治疗组及含雄激素培养对照组中AR及NF-κB的表达未见提高,无统计学意义。结论菊花总黄酮对泪腺上皮细胞可能存在拟雄激素效应,从而使AR、NF-κB表达增加,并通过上调TGF-β1的表达,可能起到在泪腺局部的抗炎作用。

兔干眼细胞模型的建立与生物学特征评价

目的:通过体外分离及培养泪腺上皮细胞,建立干眼细胞模型,分析相关炎症因子,为进一步探究干眼治疗的有效药物奠定基础。方法:体外分离培养兔泪腺上皮细胞,并采用细胞增殖实验和免疫荧光实验对原代细胞活性和纯度进行鉴定。根据脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的IC50值,采用两者的0.5倍IC50刺激兔泪腺上皮细胞,构建干眼细胞模型即LPS组和TNF-α组,并通过细胞增殖实验、ELISA和流式方法对比两种构建干眼细胞模型的相关生物学特征。结果:兔泪腺上皮原代细胞培养12h后细胞基本贴壁,48h可见细胞形态舒展,呈长三角形。兔泪腺上皮原代细胞活性为92%以上,标志角化蛋白(Pan-cytoeratin)阳性率>90%,符合实验要求。LPS和TNF-α12h的IC50分别为20μg/mL、4.996ng/mL,采用LPS(10μg/mL)和TNF-α(2.5ng/mL)干预细胞12h后:两组细胞凋亡率明显高于空白对照组(P<0.01),组间比较,TNF-α组细胞凋亡率高于LPS组(P<0.01);两组细胞上清液中IL-1β和IL-6的含量均明显高于空白对照组(P<0.01),组间比较,TNF-α组IL-1β和IL-6的含量明显高于LPS组(P<0.01)。提示TNF-α模拟干眼的炎症反应效果优于LPS。结论:本研究成功建立了一种细胞纯度较高、相对简便、快速,模型稳定的兔干眼细胞模型,为兔泪腺上皮细胞功能及干眼的基础研究提供了更稳定的体外实验模型。