兔泰泽病原体实时荧光PCR检测方法的建立

目的 建立一种适用于兔泰泽病原体检测的实时荧光PCR检测方法。方法 根据泰泽病原体的16S rRNA序列设计了特异性的引物和探针,对引物和探针浓度进行了优化,并评价其敏感性、特异性和重复性。同时,使用该方法对临床样品进行了检测,并与已报道的套式PCR方法进行比较。结果 建立了能够特异检测泰泽病原体的实时荧光PCR检测方法,该方法检测质粒标准品的最低检测限为8 copies/μL,不与SPF级实验动物必须排除的多种细菌发生交叉反应,批内和批间重复变异系数均小于3%,重复性良好。对70份临床样品的检测结果显示该方法的阳性样品检出率高于套式PCR检测方法。结论 建立的实时荧光PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,适用于兔粪球样本中泰泽病原体的检测。

反向斑点杂交检测泰泽病原体

目的建立一种简洁稳定、特异灵敏的检测泰泽病原体(Tyzzer’s organism)的反向斑点杂交方法(reverse dot blot,RDB)。方法根据泰泽病原体16S rDNA保守基因组序列设计引物和特异性探针,上游引物用生物素标记,进行PCR扩增,建立反向斑点杂交方法,用此法进行了特异性和灵敏度实验,同时,用RDB、ELISA和IFA对41只小鼠、38只大鼠进行了检测。结果 RDB特异性强,最低检测限为4.5 ng/μL。对79例实验动物的检测中,与ELISA检测结果一致性为100%,阳性率是7.59%(6/79);与IFA一致性为92.4%(73/79),IFA阳性率是0%。结论建立了PCR扩增与分子杂交相结合的准确、灵敏、特异的泰泽病原体反向斑点杂交检测方法。

对大鼠泰泽病原体的检测试验

为了验证被泰泽病原体污染的实验动物生产单位是否彻底排除了该病原体 ,以新引种繁殖的离乳大鼠和成年大鼠为检测对象 ,采用组织病理学检查、免疫荧光法和长爪沙鼠辅助检测等方法对其进行了检测。各项检测结果全部阴性 。

泰泽病原体基因组DNA提取方法的建立

目的 提取泰泽病原体基因组DNA ,为建立该菌基因组文库奠定基础。方法 使用密度梯度离心结合酶解消化方法、酶解消化方法、本研究建立方法即过滤盐析离心法 ,从感染肝脏组织纯化泰泽病原体 ,并比较三种方法纯化泰泽病原体效果 ;采用氯化苄法、试剂盒、酚法提取泰泽病原体基因组DNA ,并比较三种方法提取基因组DNA质量 ;鉴定酚法提取泰泽病原体基因组DNA特异性。结果 使用过滤盐析离心法从感染肝脏组织纯化泰泽病原体 ,采用酚法提取其基因组DNA ,所获得的基因组DNA特异性好、纯度高、DNA片段长度大于 5 0kb ,且均一性好 ,无降解。结论 本研究首次成功提取泰泽病原体基因组DNA 。

泰泽病原体单克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备多种抗泰泽病原体的单克隆抗体 ,用于该菌隐性感染的检测。方法 用含泰泽病原体的大鼠肝匀浆免疫BALB c小鼠 ,采用杂交瘤技术和间接免疫荧光方法筛选抗该菌的单克隆抗体 ;运用免疫电镜、Westernblotting和免疫双向扩散试验确定单克隆抗体的抗原定位和相对分子质量及IgG亚类型。结果 共筛选出 5种单克隆抗体 (M2、M3、M4、M5和M7)。免疫电镜表明 :抗体M2、M4、M5、和M7与泰泽病原体的细胞壁结合 ,而M3为抗菌毛的单克隆抗体 ;Westernblotting结果表明 :抗体M2、M3和M4与相对分子质量约为 6 4× 10 3的抗原有特异性结合 ,M5与M7与相对分子质量约为 4 1× 10 3的抗原特异性结合 ;M2、M5、M7为IgG1 ,M3为IgG2b,M4为IgG2a。对模拟自然感染大鼠考的松激发试验阳性为 2 10 ,而单克隆抗体为诊断抗体的IFA则为 8 10。除M7外 ,4种单抗不与清洁级以上大鼠回盲部细菌发生反应。结论 筛选的杂交瘤细胞能稳定分泌抗体 ,其IFA效价达 1∶10 2 4 ;表明这些抗体具有高效价、较高特异性和敏感性。

泰泽病原体研究现状

泰泽病原体 (Tyzzer’sorganism或Bacilluspiliformis或Clostridiumpiliformis)是一种带鞭毛、菌毛、芽胞 ,专营细胞内寄生的革兰阴性杆菌。该菌广泛存在于实验动物、家禽、家畜、宠物及非人灵长类 ,引起动物的出血坏死性肠炎和粟粒状肝坏死。对人的潜在威胁已经引起了人们的关注。由于不能在无活细胞的人工培养基上生长、繁殖和自溶性 ,导致目前对该菌的生物学特性、致病机理、遗传学、诊断和检测方法以及泰泽病的预防始终没有突破性进展。本文就泰泽病原体的生物学特性、感染和传播。

实验大鼠泰泽病原体三种检测方法的比较

目的 利用不同的检测方法调查了解我国实验大鼠中泰泽病原体的携带情况,并比较三种方法的检测结果,为合理选择实验室检测方法提供依据.方法 应用ELISA法,间接免疫荧光（IFA）法和套式PCR法三种检测方法对国内大型实验动物生产厂家送检的125只实验大鼠同时进行泰泽病原体检测,并对比分析检测结果,评估我国实验大鼠泰泽病原体的携带情况.结果 共检测125只实验大鼠,其中清洁级54只,SPF级71只,IFA法检出36只阳性,89只阴性,阳性检出率28.8%：ELISA法检出24只阳性,101只阴性,阳性检出率19.2%：PCR法检出6只阳性,119只阴性,阳性检出率4.8%;ELIsA法和IFA法阳性检出率要高于PCR法.结论 对于泰泽病原体的检测,可以采用IFA法或ELISA法进行抗体检测,对可疑的样品用PCR法验证.相比而言,IFA法具有简单,可靠、价格低廉的优点,可以用于实验大鼠泰泽病原体感染状况的初步调查和流行病学监测.

泰泽病原体nested-PCR检测方法的优化及应用研究

目的对泰泽病原体nested—PCR检测方法进行优化和应用研究。方法以感染泰泽病原体RJ株的大鼠肝组织作为阳性对照，按国标GB/T 14926．10—2008《实验动物泰泽病原体检测方法》间接免疫荧光检测fIFA）呈阳性的上海地区大鼠肝组织为材料，对本室已建立的泰泽病原体nested—PCR检测方法中的DNA抽提方法和PCR过程进行优化，并应用于22只免疫抑制实验动物的泰泽病原体检测。结果肝脏组织DNA以酚／氯仿抽提法为好；nested—PCR出现196bp的特异性条带，此方法的敏感性达1pg；产物纯化后进行测序比对分析显示，上海地区实验大鼠感染样品以及RJ株感染样品的序列均与Genbank中泰泽病原体16S rRNA（Genbank D14638．1）的同源性为100％。应用研究表明，22个样品中IFA检测阳性样品8个，阳性率为36．4％；Nested-PCR检测阳性样品13个，包含所有的IFA阳性样品，阳性率为59．1％。结论本方法灵敏度高，特异性强，经进一步应用改进后，可用于泰泽病原体的检测。

实验动物质量控制中泰泽病原体的研究进展

泰泽病原体(Tyzzer’s organism)是一种能引起实验动物肝肠坏死和腹泻的毛发状芽孢杆菌(Clostridium piliforme,旧称Bacillus piliformis)。该病原体引起的泰泽病是一种急性疾病,其发病迅速、致死率高、临床症状不明显,往往难以进行早期诊断和治疗,一旦爆发,将会造成严重的经济损失和实验室安全问题。本文从泰泽病原体的生物学特性、流行病学与疾病特征、检测方法、研究进展及防治多个方面进行综述。

实验动物泰泽氏病原体检测

采用肝压印片、姬姆萨染色，对昆明小鼠、ＮＩＨ小鼠、ＬＩＢＰ／１小鼠、Ｗｉｓｔａｒ大鼠、豚鼠、金黄色地鼠、兔进行泰泽氏病原体调查，结果表明除兔以外各种动物，均发现有泰泽氏病原体感染，并以两种形式存在于肝组织中。第一种为典型毛发样杆菌，成束状排列；第二种为杆状或梭状，菌体长短粗细不一，分散于组织间。在肝压印片中也可见到菌体芽胞和游离芽胞。

免疫磁珠分离技术纯化和检测泰泽氏病原体的研究

目的建立泰泽氏病原体(Ty)纯化方法,获得纯的菌体供抗原研究,为ELISA诊断抗原的制备提供依据;并尝试建立Ty隐性感染血清学抗原检查方法。方法选择特异性抗体包被磁珠,从感染大鼠肝脏中富集和纯化Ty;用SDS-PAGE和Western blot技术考察纯化Ty的蛋白和抗原图谱;同时用免疫磁珠分离技术(IMS)直接检查隐性感染大鼠肠道上皮细胞内的Ty。结果用辛酸-硫酸铵纯化的Ty单克隆抗体M5以0·5μg/107beads以上浓度包被抗IgG抗体预结合的磁珠4h,可最大效率地富集Ty;分离反应进行1h,敏感性达到103菌体/mL;吖啶黄染色镜检法可以直接、快速地观察到结合于磁珠上的细菌;抗原分析表明,IMS较好地去除了肝组织和真核细胞成分,纯化的Ty RJ株具有3个免疫优势的抗原成分,相对分子质量(Mr)分别为160×103、116×103、55×103;此外,IMS法可直接从隐性感染大鼠盲肠上皮细胞中检测到少量寄生的Ty。结论用IMS技术可有效地富集和纯化Ty,并可以作为Ty隐性感染血清学抗原检查的候选方法。

泰泽氏病原体抗原表位相关肽的初步筛选与鉴定

目的获得泰泽氏病原体抗原表位相关肽,用于实验动物血清中该病原体感染相关抗体的检测。方法选用泰泽氏病原体的四种单克隆抗体(M2、M3、M4、M5)作为配基,从噬菌体表面展示的随机7肽文库中筛选单抗识别的抗原表位,获得特异性噬菌体克隆;并采用ELISA、Western blot方法对其进行分析鉴定,获得阳性噬菌体克隆。结果获得阳性噬菌体克隆5个,其展示的融合蛋白能被泰泽氏病原体的免疫血清识别,ELISA检测A值的P/N为8.0～17.1;Western blot分析显示单一特异性条带,相对分子质量约为38×103。结论本研究获得的5个阳性克隆所表达的融合蛋白,为泰泽氏病原体抗原表位相关肽,可作为该病原体隐性感染血清学检测的候选抗原。