外排泵抑制剂CCCP对不同耐药机制介导的沙门菌黏菌素耐药性的逆转作用

为了寻求逆转细菌黏菌素耐药性的方法,探讨外排泵抑制剂氰氯苯腙(Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazine,CCCP)对不同耐药机制的沙门菌黏菌素耐药性的逆转作用,采用PCR技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对临床分离的沙门菌进行鉴定,采用微量肉汤稀释法测定黏菌素对沙门菌分离株的最小抑菌浓度(Minimal inhibit concentration,MIC),应用常规PCR技术和全基因组二代平台Illumina Hiseq X Ten测序技术对沙门菌黏菌素耐药机制进行分析,并分析了CCCP对不同耐药机制分离菌株黏菌素耐药性的逆转作用。结果表明,共分离鉴定出沙门菌32株,随机选择8株黏菌素耐药沙门菌为受试菌株,其中4株菌为mcr-1阳性菌株,4株为双组份信号转导系统PhoPQ和PmrAB相关基因突变菌株。8株沙门菌在加入CCCP后黏菌素MIC大幅度降低(MIC降低1/4096~1/256),CCCP对质粒介导和染色体双组份信号转导系统介导的沙门菌黏菌素耐药性均有逆转效果。

耐药猪链球菌膜蛋白图谱分析及能量抑制剂对其敏感性的影响

为证实国内临床分离的动物源链球菌菌株中是否存在与红霉素耐药性相关的主动外排机制,选取含有mefA基因和ermB基因和不含mefA/ermB基因的链球菌耐药菌株和青霉素、红霉素均敏感菌株,在能量抑制剂氰氯苯腙(CCCP)存在时,采用棋盘法分析红霉素、阿齐霉素、替米考星、青霉素对分离菌MIC的影响,并采用SDS-PAGE电泳分析分离株的膜蛋白图谱。结果显示:CCCP可对含有mefA基因的耐药菌株产生影响,可增强其对红霉素、阿齐霉素的敏感性,但不影响其对替米考星和青霉素的敏感性。含有ermB基因、不含mefA/ermB基因的耐药菌,对红霉素、阿齐霉素、替米考星和青霉素的敏感性不受CCCP的影响。菌株膜蛋白的SDS-PAGE电泳图谱显示,含有mefA基因的耐药菌株与其他菌株的膜蛋白图谱差异较大,其膜蛋白条带多而深浓,在45 000处有明显的条带,其他菌株无该条带,推测该蛋白可能是膜主动外排的相关蛋白。本试验结果佐证了在链球菌内存在与红霉素耐药相关的主动外排机制。

非多重耐药及多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵及其表达

目的 探讨多重耐药鲍曼不动杆菌（multidrug resistant Acinetobacter baumannii,MDRAB）及非多重耐药鲍曼不动杆菌（non-multidrug resistant Acinetobacter baumannii,N-MDRAB）的外排泵表型、基因型和外排泵基因表达情况。方法 应用K-B法将120株临床分离的鲍曼不动杆菌,分成MDRAB 96株和N-MDRAB 24株两组;参照Sylvia Valdezate方法检测鲍曼不动杆菌的外排泵表型,即采用微量肉汤稀释法,观察加入泵抑制剂羰基氰氯苯腙（CCCP）前后其MIC值的变化,筛选出加入泵抑制剂后MIC值比原值降低1/4倍或以上的菌株为AB外排泵表型阳性;PCR法扩增外排泵蛋白基因并测序进行序列分析。结果 96株MDRAB对β-内酰胺类、头孢菌素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类、多黏菌素类抗菌药物的耐药率分别为76.04%-92.71%、73.96%-97.92%、40.63%-42.71%、92.71%-98.96%、93.75%-98.96%、98.96%、79.17%、0。24株N-MDRAB对头孢菌素类、β-内酰胺类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类、多黏菌素类抗菌药物的耐药率分别为16.52%-20.43%、11.22%-15.65%、0、17.83%-18.26%、20.43%-23.39%、14.78%、19.57%、0。外排泵抑制检测结果显示,96株MDRAB有34株外排泵阳性,外排泵基因检测有33株adeB、32株adeR、33株adeS、33株adeJ、0株adeE和33株abeM,检出阳性率分别为97.06%、94.12%、97.06%、97.06%、0、97.06%;24株N-MDRAB未检测到外排泵阳性菌株,但外排泵基因检测有12株adeB、20株adeR、16株adeS、18株adeJ、0株adeE和16株abeM,检出阳性率分别为50%、83.33%、66.67%、75%、0、66.67%。对adeB、adeR、adeS、adeJ、abeM基因进行测序,经比对,所测序列与GenBank中序列同源性为100%。结论 外排泵基因广泛存在于MDRAB中,但在N-MDRAB中亦可以发现主动外排泵基因的存在。

CCCP泵抑制剂对多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌作用的研究

目的观察外排泵抑制剂改变鲍曼不动杆菌耐药的情况,提高泛耐药鲍曼不动杆菌的治疗效果。方法通过微量肉汤稀释法测定四环素、诺氟沙星、庆大霉素、头孢噻肟抗菌药物的最低抑菌浓度,比较加入羰基氰氯苯腙(CCCP)泵抑制剂前后96株鲍曼不动杆菌对抗菌药物MIC的变化,以加入泵抑制剂后MIC值比不加泵抑制剂降低4倍或以上作为外排泵表型阳性的判定标准。结果 96株多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌在加入CCCP前后,庆大霉素耐药率降低65.63%,耐药菌株数减少63株,其余四环素、诺氟沙星、头孢噻肟MIC值降低4倍及以上的分别有32株、41株、29株。最终进一步筛选出34株对4种抗生素MIC值均降低4倍及以上的菌株(35.42%)。结论泵抑制剂CCCP对于逆转鲍曼不动杆菌对四环素、诺氟沙星、庆大霉素、头孢噻肟等4种抗菌药物的耐药性起到重要作用。

研究鲍曼不动杆菌外排泵在氟喹诺酮类药物耐药中的作用

目的研究外排泵基因ade B的存在与鲍曼不动杆菌对氟喹诺酮类药物耐药的相关性,以及外排泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）对耐药率的影响,以探讨主动外排作用在鲍曼不动杆菌耐药中所起的作用。方法采用K-B琼脂纸片扩散法进行药敏试验,琼脂稀释法检测环丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星等3种氟喹诺酮类药物对58株鲍曼不动杆菌的MICs,同时检测在加入CCCP后3种药物MICs的变化情况。结果 58株鲍曼不动杆菌临床菌株中,45株至少对1种氟喹诺酮类药物耐药,13株对3种氟喹诺酮类药物全部敏感,总耐药率为77.6%（45/58）。加外排泵抑制剂CCCP后,鲍曼不动杆菌临床菌株对3种氟喹诺酮类药物的耐药率都降低：45株耐药株中31株外排泵表型阳性。对3种药物全部敏感的13株菌株中有1株外排泵表型阳性。鲍曼不动杆菌耐药株外排基因ade B检出率（100%）明显高于敏感株（76.9%）（χ~2=11.0,P〈0.01）。结论 CCCP在体外可以抑制鲍曼不动杆菌对氟喹诺酮类药物主动外排作用,降低鲍曼不动杆菌的MICs值。外排基因ade B的存在与鲍曼不动杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性具有相关性。

主动外排在铜绿假单胞菌耐药中的作用研究

目的观察外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)对铜绿假单胞菌耐药水平的影响,并扩增外排泵蛋白编码基因,以探讨细胞膜主动外排作用与铜绿假单胞菌耐药的关系。方法用琼脂二倍稀释法测定150株铜绿假单胞菌对四环素、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、头孢噻肟、亚胺培南和美罗培南的最低抑菌浓度(MIC),并观察在含5mg/LCCCP存在条件下MIC值的变化;用PCR法扩增外排泵编码基因oprM、mexB和mexR。结果150株铜绿假单胞菌中,有56.0%的菌株外排泵表型试验阳性,以四环素、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、头孢噻肟、亚胺培南和美罗培南作为底物,分别有17、6、12、29、35、18、31株菌在5mg/LCCCP的条件下MIC值降低≥4倍,其中有56.0%的菌株同时对>2种的药物有明显的外排作用;主动外排机制不仅存在耐药菌株,而且也存在于敏感菌株,但CCCP对耐药菌株的影响更大;oprM、mexB和mexR外排泵基因普遍存在于铜绿假单胞菌中。结论主动外排作用是铜绿假单胞菌多药耐药的重要原因之一,主动外排泵抑制剂在体外能降低多种抗菌药物对铜绿假单胞菌的MIC,外排泵抑制剂在克服细菌的耐药性方面有一定的应用前景。

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药性

目的探讨铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性和耐药机制。方法选取温州医学院附属第一医院162株铜绿假单胞菌临床分离株,采用琼脂稀释法检测抗生素亚胺培南和美罗培南对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(M IC);PCR扩增分离株外膜蛋白基因OprD2和碳青霉烯酶基因VIM、IMP、SPM、KPC,对阳性产物测序确定基因亚型;羰基氰氯苯腙(CCCP)协同抑制试验检测膜外排机制。结果 162株分离菌株中,亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为37.0%和30.9%;60株耐亚胺培南和/或美罗培南菌株(简称耐药株)中,50株对2种抗生素均耐药,另10株仅对亚胺培南耐药;耐药株中有18株OprD2基因缺失,102株不耐亚胺培南或美罗培南菌株(简称敏感株)中有20株OprD2基因缺失;耐药株中检出13株碳青霉烯酶阳性,其中5株产VIM型,8株产IMP型,敏感株中未检出VIM、IMP基因,所有菌株中未检出SPM-1、KPC基因;耐药株有48.3%外排泵表型试验阳性,以亚胺培南和美罗培南作为底物的分别有19株和24株,敏感株有10.8%外排试验阳性。结论铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药严重,与外膜蛋白OprD2缺失、产碳青霉烯酶和主动外排共同作用有关。

鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的主动外排机制

目的：研究主动外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙（CCCP）对碳青霉烯类药物抗鲍曼不动杆菌活性的影响，探讨主动外排作用在鲍曼不动杆菌耐药中所起的作用。方法应用琼脂稀释法检测鲍曼不动杆菌耐药株和敏感株在加入主动外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙（CCCP）后对亚胺培南（IMP）的最低抑菌浓度（MIC）变化情况。结果应用10 mg／L CCCP 后 IMP 的耐药率由64．39％降至34．38％，能明显增强 IMP 对鲍曼不动杆菌的敏感性，CCCP 在体外能增强 IMP 抗菌活性，主动外排机制既存在于 IMP 耐药株，也存在于 IMP 敏感株，对耐药株影响更大。结论 CCCP 在体外可部分逆转鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药性，主动外排作用是鲍曼不动杆菌多重耐药的重要机制之一。