细菌多重耐药泵的研究进展

细菌主要通过药物代谢酶将药物失活、靶向改造药物作用部位、降低细胞膜通透性和通过耐药泵主动将胞内药物泵出胞外4种方式抵抗抗生素和其他药物的毒性作用,其中细菌通过耐药泵将药物排出胞外是细菌的主要耐药机制之一,尤其是多重耐药泵,可以外排结构迥异的多种药物或对细菌有毒的代谢产物。由于细胞膜结构的不同,革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌所具有的耐药泵种类和结构也有所不同。革兰氏阴性菌中,目前发现的细菌耐药泵种类主要包括ATP结合盒超家族(ATP-binding cassette family,ABC)、耐药节结化细胞分化(resistancenodulation division,RND)家族、主要易化子超家族(major facilitator superfamily,MFS)、小多重耐药(small multi-drug resistance,SMR)家族和多药及毒性化合物外排家族(multidrug and toxic-compound extrusion family,MA-TE)。革兰氏阳性菌中,目前发现的细菌耐药泵种类主要包括ABC、MFS、SMR和MATE家族。近年来,诸多学者开展了细菌耐药泵的结构及其耐药机制的研究,并且已有新药研发团队以绿脓杆菌耐药泵MexAB-OprM的结构为作用靶点开发新的抗菌药物做了大量的探索工作,天然化合物和常规药物中也存在能够抑制耐药泵活性的化合物。作者主要针对耐药泵的分类、不同细菌中耐药泵的特征及耐药泵作为新药作用靶点的潜在应用价值进行综述。

多重耐药泵抑制剂提高肠球菌对氟喹诺酮药物敏感性的研究

目的 研究临床分离肠球菌对诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星等氟喹诺酮药物耐药的主动泵出机制。方法 收集临床分离肠球菌 ;用琼脂二倍稀释法测定多重耐药泵抑制剂利舍平或维拉帕米应用前后 ,菌株对氟喹诺酮药物 MIC的变化。结果 利舍平使所有被检测的 2 9株肠球菌对诺氟沙星的敏感性增加 (MIC下降至原值的 1/ 2或以下 ) ,使 2 3株肠球菌对环丙沙星的敏感性增加 ,但仅能增加 3株肠球菌对氧氟沙星的敏感性。应用利舍平以后 ,12株耐诺氟沙星粪肠球菌对诺氟沙星 MIC值均下降 ,11株耐环丙沙星粪肠球菌有7株对环丙沙星 MIC值下降。维拉帕米的抑制效果和利舍平相比略有差异。结论 诺氟沙星、环丙沙星的主动泵出机制普遍存在于临床分离肠球菌 ,并且是粪肠球菌对诺氟沙星、环丙沙星的耐药机制之一。

肠球菌GyrA基因突变和多重耐药泵与氟喹诺酮耐药性关系研究

目的探究肠球菌GyrA基因突变和多重耐药泵与氟喹诺酮类药物耐药性的关系。方法全部试验菌株使用VITEK 2-Compact仪器和GPI卡进行鉴定。通过PCR和单链构象多态性(SSCP)法检测对左氧氟沙星(Levo)与环丙沙星(Cip)耐药的30株粪肠球菌和10株屎肠球菌GyrA基因有无碱基发生突变,并通过基因测序确定其突变类型。检测了30株粪肠球菌在M-H琼脂中加入终浓度为20μg/mL利血平后Cip MIC值的改变。结果 PCR-SSCP分析结果表明40株对Levo和Cip同时耐药肠球菌均扩增出GyrA基因,其中有24株粪肠球菌和4株屎肠球菌的单链泳动带与粪肠球菌ATCC 29212和敏感菌株的单链泳动带相比较出现异常。其中粪肠球菌在第87位上有密码子改变:GAA变为GGA;屎肠球菌在第83位有密码子改变:AGT变为TAT,这些突变均可引起氨基酸的改变。在M-H琼脂中加入利血平可以提高部分粪肠球菌对环丙沙星的敏感性。结论用PCR-SSCP法检测40株肠球菌的GyrA基因并通过测序分析,显示有70%(28株)肠球菌碱基发生了突变,说明GyrA基因喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)突变是肠球菌对氟喹诺酮类药物耐药的重要原因,此外还有药物泵出等耐药机制的存在。

细菌耐多药外排泵的研究进展

近年来,由于抗生素的不合理及广泛使用,全球多重耐药菌和广泛耐药菌不断出现。关于细菌耐药机制中外排泵及生物膜形成的研究越来越受关注。研究发现,外排泵与生物膜形成有密切联系,不同细菌的不同外排泵对生物膜形成的影响各异,而生物膜形成又影响外排泵基因表达。本文就细菌耐多药外排泵的研究进展进行综述。

白血病多药耐药相关蛋白质类研究进展

多药耐药（multidrug resistance,MDR）最常见的机制是凋亡耐受和过表达某些能将抗癌药物从细胞内泵出的膜蛋白。过表达ABC转运子（ΑTP-binding cassette transports）转运子等膜蛋白则导致泵耐药（pump resistance）,

多重耐药泵及其调控蛋白在鼠伤寒沙门氏菌对氟喹诺酮类耐药中的作用

为探讨多重耐药泵及其调控蛋白在鼠伤寒沙门氏菌对氟喹诺酮类耐药中的作用,选取盐酸环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星等药物以及鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌噬菌体等,开展体外诱导鉴定、检测诱导菌中多种耐药泵表达水平,同时分析调控蛋白在多重耐药菌中的作用,并且探讨RamA对不同药物的影响。结果表明:鼠伤寒沙门氏菌对氟喹诺酮类耐药主要是在MdtK与AcrAB协同作用下实现的;外排氟喹诺酮类多重耐药泵的主要调控体系为RamR-RamA;细菌受新Gyr B靶位点的影响,而使其对氟喹诺酮类敏感性有所下降;同时RamA对环丙沙星突变株有一定的影响,促进了其突变株产生。由此得出,多重耐药泵及其调控蛋白在鼠伤寒沙门氏菌对氟喹诺酮类耐药中具有积极的作用。

ABC家族转运蛋白及应对抗生素耐药性的概述

细菌已经衍生出许多巧妙的策略来抵抗微生物的治疗：靶点修饰,药物失活,酶降解,或者是降低细胞内药物浓度（亦或是降低稳定性、促进药物的外流）。在这诸多策略之中,外流策略是最为普遍也最为基础的机制,然而目前而言,这种机制似乎最为重要是因为它具有授予细菌多重耐药性（MDR）表现型的能力,从而导致一些细菌株能够对目前所有已知的治疗产生耐药性[1]。

嗜麦芽寡养单胞菌外排泵SmeDEF的相关研究

目的了解临床分离嗜麦芽寡养单胞菌对临床常用抗菌药物的耐药情况,并探讨氟喹诺酮类耐药与外排泵基因之间存在的关系。方法收集2012年1月—12月宁夏医科大学总院及其附属心脑血管病医院住院患者标本中分离得到的嗜麦芽寡养单胞菌114株,采用琼脂平皿二倍稀释法测定7种抗菌药物对实验菌株的最低抑菌浓度(MIC),同批测定选择诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星3种抗菌药物加入外排泵抑制剂(利血平)后抗菌药物的MIC值。应用荧光定量PCR法检测外排泵耐药基因表达水平。结果 114株嗜麦芽寡养单胞菌有37株对诺氟沙星耐药,25株对环丙沙星耐药,15株对氧氟沙星耐药。加入泵抑制剂后筛选得到19株外排泵阳性株。2株泵阳性的耐药株均有sme D和sme F的高表达。结论用外排泵抑制剂可不同程度逆转嗜麦芽寡养单胞菌的耐药性。嗜麦芽寡养单胞菌临床菌株Sme DEF外排泵的表达强弱与其耐药性有关。

细菌的多药耐药外排泵

由于抗生素药物的不合理使用等原因,病原微生物耐药性问题日益突出,严重影响了细菌性感染疾病的治疗效果,也逐渐成为目前人类着重关注的健康问题。微生物可通过多种方式来抵御抗生素引起的毒性,其中利用耐药泵将药物直接外排的方式是细菌主要的耐药性机制之一。通过对耐药泵结构和机制的研究,有利于开发以多药耐药泵为作用靶点的细菌敏感型药物,对于降低细菌耐药性和进行临床治疗有重要指导意义。文章概述了当前细菌的多药耐药外排泵的主要分类和分布、结构特征、作用机制及表达调控等方面,阐明了多药耐药外排泵抑制剂的研究意义和价值,并对其研究前景进行展望。

临床分离金黄色葡萄球菌对大环内酯类抗生素耐药性及耐药基因的分析

文章研究了上海华山医院临床分离的金黄色葡萄球菌菌株对大环内酯类抗生素的耐药性及耐药基因的分布情况。通过MIC法对临床标本分离的27株金黄色葡萄球菌对大环内酯类抗生素药敏性进行检测,并通过PCR扩增分析其中14株菌携带的大环内酯类抗生素耐药基因。结果表明27株金黄色葡萄球菌对4种大环内酯类抗生素:红霉素、螺旋霉素I、阿奇霉素和克拉霉素的耐药率分别为74.1%,48.1%,74.1%和74.1%;对林可酰胺类抗生素林可霉素的耐药率为77.8%;对酮内酯类抗生素泰立霉素的耐药率为77.8%。分析了其中14株临床菌的23rRNA序列保守碱基位点的突变和所携带的大环内酯类抗生素耐药基因情况。结果表明这14株临床菌的23rRNA序列保守碱基位点均没有发生突变。根据耐药基因PCR检测结果,发现这14种临床菌株中,有6株ermA阳性菌和和3株ermC阳性菌,但是并没有发现ermB的阳性菌株;ermA和ermC的检出率分别是42.86%和21.43%;耐药基因ermA存在于MRSA菌株中,其阳性率85.71%;而耐药基因ermC则出现在MSSA菌株中,其阳性率42.86%。另外,耐药基因msr A在14株临床分离菌株的检出率是92.86%,但没有发现它和大环内酯抗生素的药物敏感性存在相关性。27株临床分离菌株对除螺旋霉素I外的其它5种大环内酯-林可酰胺类抗生素耐药率均大于70%。耐药基因ermA和ermC是金黄色葡萄球耐药的主要原因。

革兰氏阴性菌AcrAB-TolC多药外排泵结构数据对抑制剂研发的启示

革兰氏阴性菌的多重耐药性已成为全球广泛聚焦的问题。近年研究发现,耐药结节细胞分化(resistance-nodulation-cell division,RND)家族外排泵的过表达,与革兰氏阴性菌的多重耐药性密切相关。在RND家族中,广泛存在于革兰氏阴性菌中的AcrAB-TolC外排泵被认为是导致多重耐药性的主要原因之一。为了开发有效的抑制剂,需要对AcrAB-TolC外排泵的结构有一个清晰的认识。以往对该外排泵结构的研究主要局限于体外采用X射线晶体学技术或冷冻电镜单颗粒分析技术来解析其单个组分或全泵的结构。细胞冷冻电子断层扫描技术为揭示AcrAB-TolC外排泵在天然细胞膜环境中的组装和运行机制提供了新的见解,本文综述了AcrAB-TolC不同层级的结构数据在研发外排泵抑制剂方面的贡献。

新型可移动RND家族外排泵TMexCD-TOprJ的研究进展

抗生素被认为是现代医学的基石之一,但包括抗生素在内抗菌药物的滥用也加速了可抵抗多种抗菌药物“超级细菌”的出现。耐药基因是导致细菌产生耐药性的关键因素,可通过质粒、转座子(transposon,Tn)、插入序列(insertion sequence,IS)等可移动元件(mobile genetic elements,MGEs)进行水平转移,严重威胁公共卫生安全。近年来,面对碳青霉烯类药物和多黏菌素耐药性的暴发,替加环素被视为人类面临多重耐药细菌感染的最后一道防线。近期发现了一种主要存在于质粒上的新型可移动外排泵基因簇tmexCD-toprJ,可编码耐药结节细胞分化家族(resistance-nodulation-cell division,RND)外排泵,排出菌体内包括替加环素在内的多种抗生素,大幅提升了细菌的耐药性。tmexCD-toprJ基因簇可以随质粒等可移动元件进行水平转移,已经传播至人、动物和环境中,给公共卫生健康造成了严重威胁。然而,目前人们对于其具体结构和功能作用机制等研究仍不透彻。本文系统总结tmexCD-toprJ耐药基因的分布特征、传播机制及外排泵结构等研究现状,并基于同一健康(One Health)理念提出了阻遏其扩散的措施,为减缓tmexCD-toprJ传播提供科学依据。

沙门菌传代中(氟)喹诺酮类抗生素筛选株药敏性及相关基因突变和表达

目的研究在不同浓度(氟)喹诺酮类抗生素存在条件下,沙门菌在传代时得到的筛选株中与耐药性相关部分基因的变异和表达水平变化规律及其与耐药性间的关联性。方法使用含有一定浓度(氟)喹诺酮类抗生素的肉汤培养基对沙门菌进行培养,在含有相同浓度同类抗生素的平板上划线筛选突变株,微量肉汤稀释法测定筛选株的药敏性,聚合酶链式反应(PCR)结合DNA测序确定喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance-determining region,QRDR)基因突变,实时荧光定量PCR(real-time qPCR)法检测外排泵AcrAB-TolC编码基因表达水平。结果沙门菌(ATCC 14028s)在含有不同代、不同浓度(氟)喹诺酮类抗生素的LB培养基中培养、筛选后,筛选株对抗生素耐受性均有不同程度增加。萘啶酮酸第5~7代筛选株gyrA突变,发生Asp87Tyr变异;环丙沙星第4~7代筛选株gyrA突变,发生Asp87Asn变异;加替沙星、左氧氟沙星和德拉沙星第1~7代筛选株gyrA中均未检出核苷酸突变。随着抗生素浓度增加,各抗生素相应筛选株中外排泵AcrAB-TolC编码基因表达水平较原始菌株增加,差异有统计学意义(P<0.05),第7代菌株acrAB-tolC表达量间差异无统计学意义(P>0.05)。(氟)喹诺酮类抗生素对不同代筛选株的最小抑菌浓度(MIC)与其对沙门菌(ATCC 14028s)的MIC值比值、gyrA突变、acrAB-tolC表达水平与抗生素作用浓度和筛选代数间呈正相关。结论在(氟)喹诺酮类抗生素作用下,沙门菌可通过QRDR基因突变及增加acrAB-tolC表达适应抗生素胁迫环境;新一代(氟)喹诺酮类抗生素作用于沙门菌时,菌株QRDR靶位点突变概率降低;多次重复作用后,菌株acrAB-tolC表达量虽然增加,但表达量间差异无统计学意义(P>0.05),避免了因突变导致耐药性的进一步增强。

结核分枝杆菌毒力基因片段Rv0450c分子克隆及原核表达

目的通过分子克隆的方法对结核分枝杆菌H37Rv中编码MMPL4蛋白的Rv0450c基因以及编码该蛋白一个161氨基酸的膜内区域(I161)和一个371氨基酸的膜外区域(O371)的基因片段在大肠杆菌中的表达和纯化方法进行研究,为进一步探讨MMPL4与结核分枝杆菌耐药相关功能性研究以及抗体制备提供依据。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增Rv0450c基因片段,并克隆到原核表达载体pET28b质粒中,获得的重组质粒转化原核表达宿主大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中,经IPTG诱导后SDS-PAGE电泳方法检测重组蛋白的表达,并进行纯化。结果从结核分枝杆菌基因组H37RvDNA中成功扩增出Rv0450c基因及编码I161/O371的DNA片段,并构建原核表达质粒pET28b-Rv0450c,pET28b-I161和pET28b-O371重组MMPL4蛋白和I161在大肠杆菌中表达不明显,而膜外区域O371以包涵体形式高表达。结论 Rv0450c基因原核表达质粒可以成功构建并在大肠杆菌内较好表达,为进一步MMPL4功能研究和抗体制备打下良好基础。