多重耐药淋病流行株孔蛋白和泵蛋白的表达

为探讨外排系统、外膜通透性与淋病流行株多重耐药性的关系,应用KB法和琼脂稀释法从湛江地区分离出62株淋球菌多重耐药株;利用SDS-PAGE法测定淋球菌外膜孔蛋白的表达;采用直接荧光法测定能量抑制剂NaN3加入前后淋球菌对抗生素的摄入和积累情况,比较耐药菌与敏感菌内膜泵蛋白表达的差异。结果显示,5株多重耐药菌均有外膜孔蛋白表达的缺失或下降,同时伴有外排泵蛋白的表达。提示外排系统、外膜通透性与淋病流行株的多重耐药性密切相关。

内膜泵蛋白影响淋球菌对环丙沙星的耐药水平

目的 探讨淋球菌内膜泵蛋白同环丙沙星 (CIP)耐药的关系。方法 利用NaN3 阻断泵蛋白 ,分别测定未加入NaN3 时和加入NaN3 后淋球菌对环丙沙星的吸收和积累量。结果 淋球菌对CIP的吸收有一定的极限 ,敏感组和耐药组的吸收极限分别介于 70～ 110ng和 2 0～ 5 5ng之间。未加入NaN3 时 ,敏感组CIP积累量为 94 . 2ng ,明显高于耐药组的 39. 4ng(P <0. 0 1)。加入NaN3 后 ,耐药组CIP积累量由 39 4ng上升到 78ng(P <0 . 0 5 ) ,该水平与未加入NaN3 时敏感组比差异无统计学意义 (P >0 . 0 5 )。加入NaN3 后 ,敏感组CIP积累量为 95ng ,与未加入NaN3 时比较无明显改变 (P >0. 0 5 )。 6株敏感菌内膜上均没有泵蛋白 ,4株高水平耐药菌有泵蛋白 ,2株低水平耐药菌没有泵蛋白。结论 淋球菌内膜泵蛋白主动泵出CIP ,导致菌体内CIP积累量不足 ,这是引起淋球菌对CIP高水平耐药的重要因素 ;NaN3 可以阻断泵蛋白泵出CIP。

铁泵蛋白Ferroportin生理功能及其调控机制研究进展

铁泵蛋白(Ferroportin, FPN/SLC40A1)是目前哺乳动物中唯一已知的铁外排膜蛋白,在调控机体铁稳态代谢过程中发挥重要作用。近年,围绕FPN蛋白转运铁离子生理功能及其分子调控机制方面取得了令人瞩目的研究进展。FPN蛋白通过从细胞内向外转运Fe参与许多关键生理过程,如细胞代谢、细胞命运以及铁死亡(ferroptosis)等。铁调素(Hepcidin)作为肝脏分泌的多肽,通过与FPN蛋白结合导致FPN内化降解,从而抑制小肠铁吸收及巨噬细胞的铁再循环,因此,Hepcidin-FPN轴是机体系统性铁稳态调控的核心枢纽。然而,FPN的具体降解机制一直是铁代谢领域内的热点及难点。近期,本研究团队发现E3泛素连接酶RNF217介导FPN降解及其受TET1 (甲基胞嘧啶双加氧酶1)修饰调控铁稳态代谢的新机制。临床研究发现,携带FPN基因突变的个体出现不同临床表现的血色病。此外,有研究报道FPN在肝脏疾病、肠道疾病、心脏疾病、贫血及癌症中发挥重要作用,提示FPN或可成为防治这些疾病的关键靶点。本文系统综述了FPN在金属离子转运、疾病发生及分子调控机制等方面的国内外最新研究进展,并就未来研究方向进行了展望和讨论。

多重耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶、膜孔蛋白及β-内酰胺类靶位编码基因研究

目的研究一株多重耐药鲍曼不动杆菌(Multi-drug-resistant Acinetobacter baumannii,MDR-ABA)J65可能存在的β-内酰胺类药物耐药机制。方法 MDR-ABA J65株分离自2011年12月某三甲医院住院患者痰标本,用gyrA和parC基因PCR扩增、测序和BLASTn比对确认菌种。用PCR法分析该菌株的PBP1a、PBP2、CarO和33种A^D类β-内酰胺酶编码基因,并对检出的β-内酰胺酶编码基因作了插入序列与β-内酰胺酶编码基因连锁检测。结果 MDR-ABA J65检出β-内酰胺酶编码基因bla TEM-1、bla ADC-62、bla OXA-23、bla OXA-66,插入序列与β-内酰胺酶编码基因连锁检测显示ISaba1-ADC-62和ISaba1-OXA-23为阳性。PBP1a、PBP2和CarO编码基因序列与鲍曼不动杆菌敏感株(SDF)相比均存在有义突变,且三维结构同源建模显示,与SDF株PBP1a、PBP2和CarO蛋白分子立体结构有明显差别。结论 MDR-ABA J65对β-内酰胺类耐药机制为PBPs和孔蛋白CarO变异及可移动遗传元件介异的β-内酰胺酶编码基因。

结核分枝杆菌耐药性相关膜蛋白MmpL6的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌外排泵蛋白MmpL6(Rv1557)表达载体,在大肠杆菌E.coli中诱导MmpL6蛋白高表达并进行纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段,构建pET21b-MmpL6表达载体。将表达载体转化至大肠杆菌中,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,并针对不同表达菌株、温度进行优化,获取最优表达条件。采用Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤色谱纯化目标蛋白。结果成功构建pET21b-MmpL6重组表达质粒,经IPTG诱导后,在Rosetta菌株中25℃条件下获得最高表达量。结论成功表达并纯化了MmpL6蛋白,为该蛋白后续的结构与功能研究奠定了基础。

淋病流行株外排系统与外膜通透性和多重耐药性的关系

探讨外排系统、外膜通透性与淋病流行株多重耐药性的关系。应用K-B法和琼脂稀释法从湛江地区分离出62株淋球菌多重耐药株。利用SDS-PAGE测定淋球菌外膜孔蛋白的表达;应用直接荧光法测定能量抑制剂加入前后淋球菌对抗生素的摄入和积累情况,比较耐药菌与敏感菌内膜泵蛋白表达的差异;利用煮沸法提取细菌DNA,PCR扩增mtrR基因,并对扩增产物测序,比较敏感株与多重耐药株的差异。结果5株多重耐药菌均有外膜孔蛋白表达的缺失或下降,同时伴有外排泵蛋白的表达;5株敏感淋球菌无mtrR的突变,10株多重耐药株均有mtrR基因的突变。表明外排系统、外膜通透性与淋病流行株的多重耐药性密切相关。

烟曲霉Afssn3缺失菌株对伊曲康唑耐药的转录组学分析

在烟曲霉Afssn3缺失菌株和野生型对照菌株中分别加入伊曲康唑进行处理,并应用Illumina二代测序技术对两组样本进行转录组学测序和生物信息学分析.结果发现:经伊曲康唑处理后,Afssn3敲除菌株类固醇生物合成通路中cyp51A(erg11A)、erg24B、mes01(erg25)、smt1(erg6)、sc5dl(erg3)等基因表达显著上调,外排泵ABC转运蛋白相关的mdr4基因也显著上调;烟曲霉Afssn3敲除后,菌株可通过上调麦角固醇合成通路的药靶基因cyp51A(erg11A)和药物外排泵的转录水平等导致耐药.该研究揭示了烟曲霉Afssn3基因敲除菌株和野生型对照菌株经伊曲康唑刺激后,会出现表达差异的信号通路和相应的基因.这为烟曲霉耐药分子调控机制的研究提供了新的线索和依据.

癌的多重抗药性

用化学疗法治癌失败后可能会怪罪到一种古老的、把毒素从细胞里清洗出去的泵蛋白。找到这种泵蛋白就有希望使具有多重抗药性的癌再次能用药物来治疗。

何首乌肝损伤模型大鼠胆汁淤积现象及相关蛋白表达研究

目的观察经脂多糖(LPS)诱导后连续给予何首乌醇提液(AEP)7 d大鼠的肝损伤程度及胆汁淤积相关指标的变化。方法将雄性SD大鼠随机分为5组:对照组、LPS组、LPS+对乙酰氨基酚(APAP)组、AEP组、LPS+AEP组,LPS、LPS+APAP、LPS+AEP组按大鼠体质量分别尾iv给予4 mg/kg LPS,对照组与AEP组给予等体积生理盐水;2 h后LPS+APAP组ig给予625 mg/kg APAP,AEP组与LPS+AEP组ig给予12 g/kg,每天1次,连续给药7 d,建立特异质肝损伤炎症模型。观察体质量变化,并分别于造模后2 h、14 h、5 d、8 d检测血清生化中肝功能相关指标的变化,同时收集胆汁,计算胆汁流速与密度,并检测胆汁中主要成分变化。进行肝脏系数及组织病理学检查,并对胆汁淤积相关蛋白胆盐输出泵转运蛋白(BSEP)、多药耐药蛋白2(MRP2)及多药耐药蛋白3(MRP3)进行Real-Time PCR检测。结果经过LPS诱导2 d后,LPS+AEP组与对照组、AEP组比较体质量明显下降,5、8 d肝脏系数显著增加(P<0.05);血清生化指标分析结果显示,与对照组比较,LPS+AEP组丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平无明显变化;造模后8 d的总胆红素(TBIL)明显降低(P<0.05),ALP明显升高(P<0.05);可观察到胆汁密度和胆汁流速明显降低(P<0.05),对胆汁成分分析显示,与对照组比较,LPS+AEP组总胆固醇(TCHO)显著升高、TBIL显著降低(P<0.05);病理结果显示,AEP组出现轻微肝细胞变性,而LPS+AEP组可见严重局灶坏死;转录水平结果发现,LPS诱导后可使得BSEP、MRP2在14 h时出现短期抑制(P<0.05),单独给予AEP可使BSEP、MRP2和MRP3的表达水平短时显著升高(P<0.05、0.01),而LPS+AEP给药第8 d对大鼠肝脏BSEP、MRP2无显著性影响,可使MRP3转录水平升高(P<0.05)。结论经LPS诱导的AEP可明显损伤大鼠肝细胞并干扰胆汁分泌功能,引起胆汁成分相关生化指标的改变,对BSEP与MRP2水平无显著影响,MRP3出现代偿性升高,提示确实存在胆汁淤积症状,但可能是存在其他机制。

改变黑素小体腔内pH值影响表皮黑素细胞的黑素生成

黑素小体是一种真核生物细胞中高度特化的用于合成与贮存黑素的细胞器。它最早起源于溶酶体衍生小囊泡,为单层质膜包裹的近似封闭的酸性细胞器,其腔内环境的pH值大约是4～5。位于黑素小体膜上的酪氨酸酶,被认为是黑素合成的主要限速酶,它的最适pH值为6.8,这就意味着在酸性黑素小体内酪氨酸酶处于未活化状态。有研究表明,黑素小体膜上存在有多种不同类型的离子通道和质子泵,协同参与调节和维持着黑素小体腔内的偏酸环境。改变黑素小体腔内pH值可直接影响黑素细胞的黑素合成,为临床治疗色素异常相关疾病以及皮肤美白产品的研发提供了一个新途径。