云南泸定百合遗传多样性的表型与ISSR分析

用表型变异分析并结合ISSR分子标记对云南境内10个泸定百合(Lilium sargenttiae)居群进行遗传多样性分析。结果显示:(1)云南10个泸定百合居群的7个表型性状的居群间F值在3.26～19.1之间,表型的居群间差异均达到显著或极显著水平;平均表型分化系数为71.22%,居群间变异(59.92%)大于居群内变异(23.42%),说明居群间表型变异是泸定百合居群变异的主要来源。(2)13个ISSR引物共检测到248个多态位点,物种水平上多态位点率98.80%,Nei’s多样性指数和Shannon多样性指数分别为0.265 5和0.413 1;居群内基因多样度(Hs)为0.175 7,居群间基因分化系数(Gst)0.336 7,Mantel检验显示泸定百合居群在地理距离和遗传距离间具有显著相关性(r=0.804 4,P=0.009 9)。研究表明,云南泸定百合的居群间表型和分子水平均具有较高的遗传多样性,居群间的遗传分化较大,并且分化趋势具有明显的地域性。因此,可选择迁地种植对泸定百合进行有效保护。

云南泸定百合8个野生居群的染色体核型分析

用常规压片法,对云南省境内泸定百合（Lilium sargentiae Wilson）8个野生居群的染色体进行了核型分析,结果显示：（1）野生泸定百合8个居群均为二倍体（2n=2x=24）,染色体基数为12,共24条染色体,无B染色体;（2）核型类型均为3A,第1、2对染色体均为具中部（m）或近中部（sm）着丝点的大形染色体,且第1对染色体上均具有随体;（3）染色体长度比为1.64~2.26,平均臂比为6.43~8.22,核型不对称系数为79.82%~81.77%。研究表明,泸定百合染色体数相对稳定,染色体变异主要表现在结构变异,各个居群的染色体组成、随体数、随体位置、臂比、染色体长度比及核型不对称系数均有差异,泸定百合各居群间存在明显的核型多态性。

泸定百合根尖染色体C-带分析

利用Giemsa C-带方法对泸定百合(Lilium sargentiae Wilson)进行了研究。结果表明:泸定百合的染色体数目为2n=24,每条染色体都显示出了可以明显区别的特征带;强带主要集中在染色体的着丝粒区域,在长短臂上也显示出可以相互识别的深浅不一的带纹。通过Giemsa C-带方法可以将泸定百合的每条染色体区分开。

泸定百合多倍体诱导试验

用0.15%秋水仙碱溶液处理泸定百合(2n=2x=24)1.5年生实生苗及其他种百合的生长点后,有些植株顶芽形态呈现明显的变异。经对变异部分的形态和解剖特征作测定,其统计分析结果表明,变异植株的叶长、节间长、茎粗与未处理的植株相比差异达显著或极显著水平,但叶宽的变化不明显。在显微镜下观测变异叶片下表皮细胞和气孔,其细胞长度显著变小、宽度却几乎没有变化;气孔数量显著减少,气孔宽度增大明显、长度却略有缩小。将茎上变异部分分化出的珠芽栽植后,取其根尖细胞在显微镜下观察,看到有相当一部分细胞的染色体数已变为2n=4x=48。

野生泸定百合种子休眠和萌发习性的研究

野生泸定百合属于百合科百合属多年生草本植物,其药用和园艺观赏价值极高,自然条件下泸定百合种子的萌发率极低,主要依靠幼芽鳞茎的形式来繁殖后代。为研究和确定云南野生泸定百合种子休眠和萌发的习性,本研究设置了不同光照、不同温度条件下种子的萌发试验,具体为在有光照(光照12 h/d)和无光照的黑暗条件下,分别设置了恒温20℃、30℃和20～30℃变温时种子的萌发试验;设置了5℃低温层积处理后种子的发芽试验,层积时间分别为7、14、21、28d和60 d;以及100 mg/L赤霉素处理后,种子于光照和黑暗条件下的发芽试验。结果表明:恒温20℃和20～30℃变温的黑暗条件,适宜野生泸定百合种子的萌发,表现为萌发时间最短、发芽率达到了最高(45%);100 mg/L的GA3处理对种子的萌发有明显促进作用,可加快和缩短种子萌发时间,提高种子发芽率;而5℃的低温层积对野生泸定百合种子的萌发在萌发时间和发芽率方面没有明显促进作用。

镰刀菌诱导的泸定百合SSH文库构建及抗病相关基因筛选

该研究以泸定百合(Lilium sargentiae Wilson)为材料,构建其组培苗经百合尖孢镰刀菌侵染后的叶片SSH文库,从中筛选镰刀菌枯萎病抗病相关基因。从正向SSH文库中随机挑取300个单克隆测序后得到280条ESTs,进行功能比对分析后,除去未知功能、沉冗蛋白以及无同源序列,得到有功能的ESTs共168条,其功能涉及信号传导、蛋白质合成与代谢、抗病与防御、物质与能量代谢、转录相关等多种途径,其中有31条ESTs与抗病防御相关。从抗病防御相关基因中选取8条ESTs:过氧化氢酶、ATP结合盒转运蛋白(ABC transporter)、Kunitz型胰蛋白酶抑制剂4(Kunitz trypsin inhibitor 4)、丝氨酸乙醛酸氨基转移酶、多聚泛素、脂氧合酶I(Lipoxygenase I)、丝氨酸/苏安酸蛋白激酶(Serine/Threonine-protein kinase)、抗坏血酸过氧化物酶(Arabidopsis thaliana),通过RTPCR对其表达情况进行分析,发现经镰刀菌诱导后均为上调表达,推测它们可能参与了泸定百合镰刀菌枯萎病的抗病反应途径。

泸定百合转录组测序与特性分析

泸定百合是非常优良的种质基因资源,鳞茎研究是其科研和生产的关键环节,然而泸定百合鳞茎的分子生物学研究尚属空白。为揭示泸定百合鳞茎的分子机制,应用高通量测序技术对泸定百合的鳞茎进行转录组分析。原始数据经过生物信息学分析后,共获得4.9G有效数据,43 412条Unigene;所获得的Unigene与NR,GO,COG和KEGG等数据库进行搜索比对后,发现有30 225条和21 531条Unigene分别获得NR和GO注释,14 069条Unigene得到COG注释,GO注释中获得374条Unigene可能作为转录因子参与泸定百合鳞茎的形成与发育;共有10 822条Unigene参与了KEGG代谢途径,其中有571条Unigene注释到次生代谢合成途径,其中66条和23条Unigene分别参与了萜类和生物碱的合成。研究结果为采用生物技术手段提高百合的药用成分的含量及改善其园艺性状积累了基本资料。

泸定百合过氧化氢酶(Ls-Cat1)基因的克隆及表达分析

过氧化氢酶(CAT)参与植物的多种胁迫反应。为探究百合中的CAT基因与百合抗镰刀菌病害的关系,根据百合尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)诱导的泸定百合(Lilium sargentiae Wilson)SSH文库中筛选到的CAT基因中间序列片段,通过RACE结合RT-PCR技术从泸定百合中克隆到1个CAT基因全长c DNA序列,该基因全长1 743 bp,包含1个1 479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸,命名为LsCat1(Gen Bank登录号:KU355272)。序列比对分析表明,Ls-Cat1编码的氨基酸序列中包含已确定的CAT保守基序。系统进化树分析显示,Ls-Cat1与其它物种CAT基因编码的氨基酸序列具有较高的相似性。qPCR结果显示,Ls-Cat1经百合镰刀菌诱导后明显上调表达,推测该基因可能与百合抗镰刀菌病害相关。本研究结果为揭示百合对镰刀菌枯萎病的抗病分子机制提供了一定的理论依据。

蔗糖和光周期在泸定百合试管鳞茎膨大中的作用机制

为研究蔗糖和光周期对泸定百合试管鳞茎膨大的影响及其交互作用,解释两者在鳞茎膨大过程中的作用机制,以泸定百合种球鳞片为外植体诱导形成的无菌丛芽为材料,采用不同质量浓度(30、60、90g/L)蔗糖与不同光周期(0、8、12、16、24h/d)的组合处理,测定鳞茎发生和膨大的形态指标及其内源性糖含量与相关酶活性的变化.结果显示:1)在蔗糖质量浓度为60g/L、光周期为8h/d组合处理下,鳞茎膨大效果最好,与全黑暗处理间无显著差异.2)在30g/L蔗糖和各光照时间处理下,蔗糖含量变化趋势为W型,果糖和葡萄糖含量变化趋势为M型;而在60和90g/L蔗糖处理下,蔗糖含量呈先下降后升高再下降趋势,果糖和葡萄糖含量变化趋势与蔗糖含量变化趋势相反.3)在不同质量浓度蔗糖处理下,蔗糖磷酸合成酶活性的变化趋势与蔗糖含量变化趋势基本一致,而蔗糖合成酶活性的变化趋势与蔗糖含量变化趋势相反.综上,蔗糖质量浓度和光周期对试管小鳞茎的发生和膨大存在交互作用,但蔗糖对百合鳞茎生长与膨大影响更大,是造成鳞茎诱导及膨大的主要因子;蔗糖合成酶参与蔗糖分解代谢过程,而蔗糖磷酸合成酶参与蔗糖积累过程;蔗糖不仅在膨大过程中扮演了生理角色,还可能扮演了糖信号角色,并且这些过程都受到严格的浓度调控.在生产中,推荐的最适组合为蔗糖质量浓度60g/L,光周期0h/d.

离体条件下2种除草剂诱导泸定百合多倍体的比较研究

在离体条件下,以野生泸定百合(Lilium sargentiae)不定芽(2n=2x=24)为材料,以无菌水(CK)和秋水仙素为对照,分别用不同浓度(100、200、300μmol/L)除草剂(氟乐灵、二甲戊灵)溶液分别浸泡(12h、24h、36h)处理,通过根尖细胞染色体数和叶片下表皮保卫细胞及叶片形态特征观察,比较2种除草剂不同浓度及不同处理时间对泸定百合多倍体诱导的效果。结果表明:300μmol/L二甲戊灵浸泡36h,变异率达30.0%,200μmol/L氟乐灵浸泡36h,变异率达32.2%,但2种诱变剂处理后材料诱导变异和存活率的差异不显著。对变异材料通过细胞学鉴定,发现2种诱变剂均能够诱导出四倍体泸定百合,但与秋水仙素处理相比,2种诱变剂处理时间短,材料死亡率低,变异率较高,而且对人畜伤害小,成本低;此外,与二倍体植株相比,四倍体植株的叶片气孔显著增大、气孔密度显著降低。研究认为,除草剂二甲戊灵和氟乐灵可作为秋水仙素诱导多倍体的替代品,而且叶片气孔大小可作为初步快速检测多倍体的有效指标。

宜昌百合、泸定百合核型分析

用常规压片法对重庆金佛山的宜昌百合与四川宝兴的泸定百合进行了核型分析。结果为两种染色体数目均为24,核型类型均为3B型,核型公式均为2n=2x=24=4m(2SAT)+10st(2SAT)+10t。2个种均在第1对染色体短臂上有居间随体,但另一对随体位置有差异。宜昌百合核型不对称系数80.91%,泸定百合不对称系数为78.72%。宜昌百合核型为首次报道。

野生泸定百合鳞片的组织培养技术

为野生泸定百合资源的保护及开发应用提供依据,以其鳞片为外植体,观察其不定芽的诱导、增殖以及生根培养情况。结果表明:野生泸定百合鳞片用0.1%升汞消毒15 min,效果较好;MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L为野生泸定百合鳞片最佳不定芽诱导培养基,平均每鳞片分化芽数达5.4个;MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.05mg/L为鳞片最佳增殖培养基,增殖系数达7.66;1/2MS+IBA 1.0mg/L为鳞片最佳生根培养基,生根率达95.2%,平均根数5.3条,平均根长3.9cm。

南川百合与泸定百合种群格局关联维数的比较研究

本文采用分形理论中的关联维数比较分析了南川百合与泸定百合种群的空间分布格局及其分形特征。结果显示，南川百合与泸定百合种群的关联维数都不大（小于或接近1．5，比较远离2），说明其种群个体空间相关程度低，个体间竞争不激烈，种群整体对空间的占据能力不强，体现其在群落中的劣势伴生地位。在2006年，若只比较人为干扰小的种群，则南川百合5个种群的平均关联维数（1．1295）比泸定百合4个种群（1．5154）小25．46％；若不考虑人为干扰，在所有的样地中进行比较，那么，在2006年，南川百合5个种群的平均关联维数（1．1295）比泸定百合6个种群的（1．4496）小约22．08％，而在2005年，南川百合5个种群的平均关联维数（1．3671）也比泸定百合3个种群的（1．3673）要小一些，这些数据表明，与泸定百合种群相比，南川百合种群个体空间相关程度低，种群整体占据生态空间的能力弱。在高温干旱的2006年，这两种百合种群的平均关联维数与2005年相比都有所减少，但南川百合种群的平均关联维数的减少比例（17．38％）大于泸定百合的减少比例（6．26％），其减少比例约为泸定百合的2．78倍，这些数据表明，高温干旱天气会降低南川百合和泸定百合种群的适应能力，泸定百合的抗热抗旱能力要高于南川百合，南川百合更易受高温干旱天气的伤害。南川百合和泸定百合均出现濒危迹象，但因南川百合抗热抗旱性和占据生态空间能力更弱，导致其更加处于濒危状态．鉴此，应尽快在南川百合的主要分布区建立自然保护小区以保护其自然环境，同时与迁地保护相结合，并进一步探讨其濒危机制，以为这种百合的种质资源保护提供理论依据。

南川百合与泸定百合种群格局分形特征的分析

本文应用计盒维数和信息维数比较分析了南川百合与泸定百合种群的空间分布格局及其分形特征。研究显示，南川百合与泸定百合种群的计盒维数和信息维数均较小（〈1．5，远离2），说明其占据生态空间的能力和格局强度都不大，体现其在群落中的劣势伴生地位。在2006年，南川百合各种群的平均计盒维数（0．7232）比泸定百合（0．7734）小0．0502，而其平均信息维数（0．4179）却比泸定百合（0．2381）大0．1798，这些数据表明，南川百合种群占据生态空间的能力比泸定百合弱，但其种群格局强度要比泸定百合种群大得多。在高温干旱的2006年，这两种百合的计盒维数与2005年相比都有所减少，信息维数都有所增加，但南川百合种群计盒维数的减少比例（13．87％）大于泸定百合（8．97％），约为泸定百合的1．54倍，其信息维数的增加比例（6．830%）却小于泸定百合（33．02%），泸定百合种群信息维数的增加量是南川百合种群的4．98倍，这些数据表明，高温干旱天气对这两种百合的生长均有影响；泸定百合的抗热抗旱能力要高于南川百合，南川百合更易受高温干旱天气的伤害。由于人为干扰和气候等环境因子的变化，南川百合和泸定百合均出现濒危迹象，此外，因南川百合抗热抗旱性能不强、占据生态空间能力弱等，导致其更加处于濒危状态，应尽快加以保护。

两种百合种群空间分布格局对高温干旱气候的响应

将分形分析与方差均值比率及聚集强度指数相结合,比较分析了南川百合与泸定百合种群在高温干旱影响下的空间分布格局及其分形特征。研究表明:分形分析同方差均值比率及聚集强度指数测定得到的结果基本一致,说明分形维数不仅可以很好地反映种群的空间分布格局,也能很好地反映种群动态;两种百合种群的聚集强度均受到2006年高温干旱的影响,但南川百合种群所受影响比泸定百合大;两种百合的平均计盒维数和平均信息维数与2005年相比均减少,但南川百合种群平均计盒维数的减少比例(13.00%)约为泸定百合(9.04%)的1.44倍,平均信息维数的减少比例(22.71%)约为泸定百合(3.43%)的6.63倍,高温干旱天气对这两种百合的生长均有影响,泸定百合的抗热抗旱能力要高于南川百合,南川百合更易受高温干旱天气的伤害。与泸定百合相比,南川百合是一个比较脆弱的物种,在高温干旱等异常气候的影响下更易导致濒危,应尽快加以保护。

云南泸定百合12个野生居群的核型研究

用常规压片法对云南省境内的12个泸定百合(Lilium sargentiae Wilson)野生居群进行了核型分析研究。结果表明:12个泸定百合野生居群全部为二倍体,染色体基数为12,共有24条染色体,无B染色体,核型类型均为3A,第1、2对染色体均为具中部(m)或具近中部(sm)着丝点的大型染色体,且第1对染色体上均具有随体。12个居群的核型不对称系数较高,在78.66%～82.05%之间,说明泸定百合的核型对称性低,进化程度较高。根据核型不对称系数,认为12个泸定百合野生居群的进化程度从高到低为:马关居群>石坎居群>龙陵居群>旧城居群>石林居群=泸西居群>双河居群>西畴居群=师宗居群>大关居群>文山居群>扎西居群。聚类结果显示,当阈值取1.04时,可以将12个居群分为3类。研究表明,泸定百合染色体数相对稳定,染色体变异主要表现在结构变异;各个居群的染色体组成、随体数、随体位置、臂比、染色体长度比及核型不对称系数均有差异;泸定百合各居群间存在明显的核型变化。

泸定百合居群染色体形态研究

研究了7个泸定百合居群的染色体形态变异,结果如下:(1)南涧居群K1=2n=2x=24=2m(2SAT)+2m+4st(2SAT)+4st+12t,染色体长度比2.62,平均臂比8.63,As.K.值81.20%.(2)弥勒居群K2=2n=2x=24=2m(2SAT)+2m(2SAT)+2st(2SAT)+2st(2SAT)+2st+14t,染色体长度比2.57,平均臂比8.69,As.K.值81.12%.(3)峨眉居群K3=2n=2x=24=2m(2SAT)+2m+2st(2SAT)+6st+12t,染色体长度比2.39,平均臂比7.84,As.K.值80.62%.(4)路南居群K4=2n=2x=24=2m(2SAT)+2m+6st+14t,染色体长度比2.39,平均臂比7.31,As.K.值80.49%.(5)澄江居群K5=2n=2x=24=2m(2SAT)+2m+2st(4SAT)+2st(2SAT)+4st+2t(2SAT)+10t,染色体长度比2.28,平均臂比7.66,As.K.值80.59%.(6)文山居群K6=2n=2x=24=2m(2SAT)+2m+2st(4SAT)+2st(2SAT)+2st(2SAT)+14t,染色体长比2.24,平均臂比8.81,As.K.值81.47%.(7)思茅居群K7=2n=2x=24=2m(2SAT)+2m(2SAT)+2st(4SAT)+2st(2SAT)+2st(2SAT)+2st+12t,染色体长度比2.52,平均臂比8.09,As.K.值81.03%.泸定百合各居群核型公式和核型类型基本相同,与百合属植物的核型变异趋势一致;但由于结构变异,在染色体相对长度、臂比和次缢痕数目及其分布有变化.正是由于泸定百合各居群存在的染色体结构变异。

泸定百合丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(LsS/TK)的克隆与表达分析

本研究根据从之前已构建的百合尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)诱导的泸定百合(Lilium sargentiae Wilson)SSH文库中筛选到的一个S/TK EST序列,通过RACE结合RT-PCR技术克隆到1个泸定百合S/TK基因全长cDNA序列,该基因全长2016 bp,开放阅读框长1440 bp,编码479个氨基酸,命名为LsS/TK。保守域结构分析表明Ls S/TK具有典型的S/TK激酶保守亚结构域。进化树分析结果显示LsS/TK与拟南芥的APTK19的进化关系最近,而与其它植物的S/TK的进化关系都较远。实时定量PCR结果显示百合镰刀菌诱导后LsS/TK表现上调表达,推测该基因可能在一定程度上参与泸定百合抗镰刀菌病害途径。

泸定百合普洱居群遗传与变异研究

从居群生物学的角度出发,对泸定百合普洱居群在形态、染色体和分子3个层次的遗传与变异进行了调查研究,统计近20个性状,其结果为:①形态性状在居群内具有丰富的多态性.营养性状的变异大于生殖性状;②泸定百合核型变异在居群内的差异不大.普洱居群核型公式为2n=24=4m(2SAT)+8st(4SAT)+12t.染色体变异主要以个体和细胞间的结构变异为主;③泸定百合普洱居群RAPD分析结果显示出较高的遗传变异水平,5个RAPD引物的多态条带比率(PPB)平均为56.4%.

泸定百合遵义居群与牟定居群的遗传多样性研究

采用居群遗传学的原理和方法,对泸定百合遵义居群与牟定居群展开了形态和细胞层次的调查研究.共统计2个居群的20余个形态性状,分析其核型和及变异式样,得出如下结果:①形态性状在居群内具有丰富的多态性.形态性状变异在居群间的分配量为21.16%,在居群内的分配量为78.84%.形态性状变异主要来源于居群内.②泸定百合遵义居群的核型公式为2n=24=4m(2SAT)+4st(4SAT)+16t,泸定百合牟定居群的核型公式为2n=24=4m(4SAT)+8st(4SAT)+12t.8.51%的染色体结构变异来源于居群间,91.49%的变异来源于居群内.