超高效液相色谱法同时测定洋常春藤中8种成分含量

建立了同时测定洋常春藤中绿原酸、隐绿原酸、芦丁、烟花苷、常春藤皂苷C、常春藤皂苷D、常春藤皂苷B和α-常春藤皂苷8种成分的超高效液相色谱法(UHPLC)。以80%甲醇为溶剂,将药材粉末于85℃、料液比1∶100条件下水浴回流1 h,制备供试品溶液;采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C 18(2.1 mm×100 mm,1.8μm)色谱柱,以乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱。结果表明,上述8种成分均获得良好的分离度;仪器精密度、方法重复性的相对标准偏差(RSD)均小于3.0%;样品溶液在室温条件下24 h内稳定;8种成分在对应质量浓度范围内线性关系良好(r≥0.9995),检出限为0.40~10.58μg·mL^-1,定量下限为1.31~34.61μg·mL^-1,平均回收率为97.3%~108%,RSD(n=6)为0.51%~3.2%。该方法适用于洋常春藤中上述8种化学成分的定量分析。

离子色谱-脉冲安培检测法测定洋常春藤游离糖成分含量

目的建立测定洋常春藤中游离糖成分含量的离子色谱-脉冲安培检测法。方法色谱柱采用Thermo DionexCarboPac PA1分析柱(250 mm×4 mm)和Thermo DionexCarboPac PA1保护柱(50 mm×4 mm),流动相为超纯水(A)-50 mmol/L NaOH和1 mol/L NaAc溶液(B)-100 mmol/L NaOH溶液(C),梯度洗脱(0~13.00 min时82%A、18%C,13.10~22.00 min时70%A、30%C,22.10~31.00 min时67%A、15%B、18%C,31.10~32.00 min时82%A、18%C),流速为1.0 m L/min,柱温为25℃,进样量为10μL。采用四电位脉冲安培检测器检测。结果海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、D-无水葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-核糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸在各自的质量浓度范围内线性关系良好;阿拉伯糖、D-无水葡萄糖、D-果糖、蔗糖的平均回收率分别为99.21%,97.84%,97.32%,96.20%,RSD分别为3.46%,3.85%,2.94%,3.28%(n=6)。结论该方法结果准确、可靠,重复性好,可用于洋常春藤中12种游离糖成分含量的分析和质量控制。

HPLC-MS/MS法分析中华常春藤与洋常春藤化学成分

目的采用HPLC-MS/MS法分析中华常春藤与洋常春藤的化学成分。方法中华常春藤与洋常春藤80%甲醇提取物的分析采用Hypersil Gold C_(18)色谱柱(100 mm×2.1 mm,3μm);流动相0.05%甲酸-甲醇,梯度洗脱;体积流量0.3 mL/min;检测波长205 nm。采用电喷雾(ESI)离子源,在正负离子模式下采集数据。结果通过相对分子质量、参考文献、对照品和数据库等提供的化学信息,从2种常春藤中鉴定或推断出53种成分。结论该方法准确稳定,重复性好,可用于中华常春藤叶和洋常春藤叶的质量控制。

不同灭菌剂对洋常春藤夏季扦插成活率的影响

筛选市场上常用灭菌药物对洋常春藤扦插基质进行灭菌,以提高夏季扦插成活率,选出灭菌效果好、价格便宜的药品。结果表明,以多菌灵为杀菌剂的腐烂率与清水(对照)的一样,都为100%;其次为甲霜灵(97.5%);再次为百菌清(93.8%);较低的为敌磺钠(31.3%)、青霉素(25%)。说明敌磺钠和青霉素的杀菌效果较好。

干燥温度、产地和采摘时间对洋常春藤叶中2种皂苷的影响

目的考察干燥温度、产地和采摘时间对洋常春藤Hedera helix L.叶中常春藤皂苷C、α-常春藤皂苷的影响。方法分别在60℃、70℃、80℃、90℃、105℃温度下,对来自2个产地、不同采摘时间的3批洋常春藤叶进行鼓风干燥处理至恒重;采用HPLC法分析各洋常春藤炮制品中2种皂苷的含有量;将不同批次、不同温度下洋常春藤炮制品粉末按适宜比例混合,采用带约束的最小二乘最优化方法确定其比例。结果 3批洋常春藤叶中常春藤皂苷C的含有量均随温度升高而增高,而α-常春藤皂苷含有量随温度的升高而降低;混批洋常春藤炮制品中2种皂苷含有量的测定值与目标值误差小于5.5%。结论 3种因素对洋常春藤叶中2种皂苷含有量的影响顺序为干燥温度﹥产地﹥采摘时间。合理混合不同质量的洋常春藤炮制品可使2种皂苷的含有量稳定在特定范围内。

洋常春藤法呢基焦磷酸合酶基因的克隆与序列分析

以洋常春藤叶片为材料,采用同源RT–PCR方法,克隆获得了洋常春藤法呢基焦磷酸合成酶基因,其c DNA序列大小为1 050 bp,开放阅读框为1 026 bp,推测编码342个氨基酸残基,该序列的核苷酸、氨基酸与五加科植物有同源性;用在线数据软件进行分析,推测该蛋白可能存在于细胞质之中,定位在细胞膜外,FPS蛋白的相对分子质量为39 735.7;该蛋白含有2个天冬氨酸保守结构域,其二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主;双子叶植物系统进化树分析结果表明,洋常春藤的FPS与刺五加、人参、三七、西洋参、辽东楤木的FPS亲缘关系最近,这一结果符合传统的分类法规则。

铅胁迫对洋常春藤生长及生理特性的影响

以洋常春藤扦插苗为试验材料,研究不同浓度(50、200、400、800μmol/L)重金属Pb2+胁迫对其生长及生理特性的影响。结果表明:在低浓度(50、200μmol/L)铅胁迫下,洋常春藤株高和节间距显著低于对照组,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及MDA含量均低于对照组但差异不显著,洋常春藤各器官的生物量、过氧化物酶(POD)活性及可溶性蛋白均显著高于对照组,氧自由基含量变化不显著;当铅胁迫浓度达到400μmol/L时,洋常春藤株高、节间距、茎生物量、POD及CAT活性和氧自由基含量显著增高,而叶生物量及SOD活性显著下降,其余指标与对照相比差异不显著;在高浓度(800μmol/L)铅胁迫下,植株的株高、节间距、POD活性、可溶性蛋白含量均增加,且株高和节间距均表现出显著增加,CAT活性、MDA和氧自由基含量变化不显著,其中叶生物量、总生物量和SOD均与对照组相比显著下降。因此,洋常春藤对铅胁迫有较强的耐受性,低浓度铅胁迫在一定程度上促进其生长,而高浓度的铅胁迫对其叶片的生长有抑制作用,但会导致该植物的节间徒长。

镉胁迫对洋常春藤生长及生理特性的影响

以当年生洋常春藤扦插苗为研究对象,用CdCl_2溶液对其进行镉胁迫处理,研究不同浓度镉胁迫对其生长形态和抗氧化酶系统的影响。结果表明:在20μmol/L和80μmol/L镉胁迫处理下,洋常春藤生长及生物量累积受影响较小,其根系和节间出现不明显的伸长,超氧阴离子、丙二醛含量差异不显著,但在80μmol/L镉胁迫下,过氧化氢酶和过氧化物酶活性比对照分别升高5和6倍。在400μmol/L镉胁迫下,其株高、节间长、叶片数以及叶生物量与对照相比均显著降低,而超氧阴离子和丙二醛的含量分别比对照增加72.3%和56.2%;可溶性蛋白、脯氨酸含量、抗坏血酸过氧化酶和过氧化物酶活性均显著增加,分别比对照高了约2倍、6倍、2倍和14.7倍,说明此时渗透调节物质的累积及抗氧化酶活性的提高不足以缓解高镉胁迫造成的过氧化伤害。可见,洋常春藤可通过调节部分渗透物质如可溶性蛋白、脯氨酸含量,以及调控抗氧化酶系统中的过氧化氢酶和过氧化物酶活性等来抵抗较低浓度的镉胁迫。

铅胁迫对洋常春藤叶绿素荧光特性的影响

以洋常春藤Hedera helix扦插幼苗为材料,采用不同浓度(0,50,200,400,800μmol·L-1)的Pb(CH3COO)2溶液进行处理,通过测定其叶片叶绿素含量、叶绿素荧光参数的变化,探讨洋常春藤对重金属铅胁迫的抗逆性。结果表明,与对照相比,铅胁迫使洋常春藤叶片叶绿素含量显著下降(P<0.05),叶绿素a/b比值增加;与对照相比,Pb2和Pb3(200和400μmol·L-1)即中度铅胁迫下,洋常春藤叶片初始荧光(F0)和非光化学猝灭系数(qN)显著上升(P<0.05),光系统PSⅡ实际光合效率(Yield)、光化学猝灭系数(qP)以及光合电子传递速率(ETR)显著下降(P<0.05),而PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)无显著变化;在重度铅胁迫Pb4(800μmol·L-1)下,F0及qN显著上升(P<0.05),其余指标均显著下降(P<0.05)。相关性研究表明,铅胁迫使得洋常春藤叶片的叶绿素a和叶绿素b极显著正相关;其qP与ETR极显著正相关,且两者与Yield均极显著正相关。研究发现,轻度铅胁迫Pb1(50μmol·L-1)虽使得洋常春藤叶绿素含量下降,但对其PSⅡ无明显影响,中度铅胁迫对洋常春藤PSⅡ有一定的影响,而重度铅胁迫会导致其PSⅡ明显的损伤。

洋常春藤和金边吊兰对香烟烟雾的净化效果与生理响应

以洋常春藤(Hedera helix L.)和金边吊兰(Chlorophtum comosum variegaturn Hort.)为研究对象,在长、宽、高均为60 cm的玻璃装置中,模拟人的吸烟方式,注入2支香烟,测定48 h内CO和PM2.5浓度变化,观察处理前后植物的表型变化,并测定植物叶片生理指标变化,以研究2种垂吊植物对香烟烟雾净化能力及生长生理响应。结果表明,洋常春藤和金边吊兰均可在一定程度上吸收或吸附CO与PM2.5,净化密闭环境中的空气,且洋常春藤的单位叶面积的净化能力优于金边吊兰;香烟烟雾处理对植物生长产生了一定的影响,叶片出现黑褐色斑点或叶缘焦枯状;香烟烟雾处理后,2种植物叶片活性氧(超氧阴离子和过氧化氢)水平显著增加,造成膜脂过氧化产物丙二醛含量增加,植物通过增强过氧化物酶活性或增加脯氨酸的合成,抵御伤害,且金边吊兰的抗性强于洋常春藤。

洋常春藤甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因HhMVD的克隆与表达分析

甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(Mevalonate diphosphate decarboxylase,MVD)是三萜皂苷生物合成途径中的关键酶,为研究其在洋常春藤中的基因功能,通过RT-PCR和RACE技术从洋常春藤叶片中克隆获得HhMVD基因的cDNA全长序列,并通过RT-qPCR技术分析其表达规律。结果表明:RACE克隆获得的HhMVD基因cDNA序列全长1 799 bp,包含一个完整开放阅读框(ORF)1 263 bp、5′非编码区(5′UTR)192 bp、3′非编码区(3′UTR)344 bp;该基因编码420个氨基酸,分子质量46.6ku,理论等电点为6.57,不含跨膜区,属于非分泌型蛋白;HhMVD蛋白具有GHMP激酶N端结构域,属于甲羟戊酸激酶系列,与刺五加、人参、三七等同科植物亲缘关系较近。RT-qPCR结果表明,洋常春藤中HhMVD基因的时空表达相对稳定,但与常春藤皂苷含量差异变化之间存在一定的负相关性。洋常春藤HhMVD基因的成功克隆及表达分析研究,为深入探讨其基因功能、阐明其在常春藤皂苷生物合成途径中的作用提供理论依据。

镉胁迫对洋常春藤叶绿素荧光特性的影响

以洋常春藤扦插苗作为实验对象,分别对其进行不同浓度的CdCl2溶液水培处理,测定并分析镉胁迫对其叶绿素含量及荧光参数的影响。结果表明:在镉胁迫下,洋常春藤叶片的叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素含量均显著降低,叶绿素a/b比值显著升高,且变化程度随着镉胁迫浓度的增大而增大。在浓度20、80μmol/L的镉胁迫下,洋常春藤的叶绿素荧光参数光系统Ⅱ潜在最大光化学效率、光系统Ⅱ实际光化学效率、非光化学淬灭、光化学淬灭、电子传递速率无显著变化,说明在浓度小于80μmol/L的镉胁迫下洋常春藤叶绿素荧光参数光系统Ⅱ光合机构功能状态良好。而在浓度200、400μmol/L的镉胁迫下,尤其是400μmol/L时,可导致其光合机构受损,表现为潜在最大光化学效率、光系统Ⅱ实际光化学效率、非光化学淬灭和电子传递速率的显著降低,叶片初始荧光显著升高,说明此浓度的镉胁迫对洋常春藤的叶绿素荧光参数光系统Ⅱ光合机构功能有抑制作用。

常春藤秋季光合日变化特性研究

采用Li-6400光合测定系统,以三年生常春藤(Hedera nepalensis var.sinednsis Rehd.)为研究对象,测定其秋季光合特性日变化。结果表明,常春藤净光合速率日变化呈双峰曲线,"午休"现象并不明显,净光合速率最高峰出现在8∶00,次峰出现在11∶00,日最大净光合速率为4.943 3μmol/(m2.s)。净光合速率与蒸腾速率、气孔导度呈正相关,与胞间CO2浓度呈负相关。常春藤的光合日变化特性表明其为典型的耐阴植物,对光照的适应性较强。

洋常春藤皂苷类化合物代谢累积规律研究

目的以洋常春藤Hedera helix 1年生扦插苗为材料,通过检测不同部位及1年生长周期内4种常春藤皂苷类化合物(α-常春藤皂苷、常春藤皂苷C、常春藤皂苷B和常春藤皂苷D)的量,分析洋常春藤皂苷类化合物代谢累积规律,以期为确定药用洋常春藤原料的合理采收时间提供理论依据。方法实验通过合理设计洋常春藤材料的采样方法,采用HPLC法测定常春藤皂苷类化合物量。结果洋常春藤不同部位皂苷类化合物量测定结果为老叶>新叶>茎>根,并且在一年的生长周期内,不同常春藤皂苷类化合物在不同采样部位中的动态累积规律均有所不同。结论洋常春藤叶片和茎均可作为高质量药用原料的采收部位,且叶片的最适宜采收时期为3月份开始的生长发育期,而茎的适宜采收时期则可以从3月份开始的生长发育期持续到低温休眠开始前的11月份。

一测多评法测定洋常春藤及其提取物中4个主要皂苷类成分

目的:建立洋常春藤及其提取物中常春藤萜苷C、α-常春藤素、常春藤萜苷D、常春藤皂苷B等4个主要皂苷成分一测多评定量检测法。方法:以常春藤萜苷C为参照成分,建立该成分与α-常春藤素、常春藤萜苷D、常春藤皂苷B的相对校正因子,采用校正因子计算这3个常春藤皂苷的含量。考察不同品牌色谱仪、色谱柱、检测波长、柱温、流速下各相对校正因子的变化,评价各校正因子的耐用性。分别采用外标法和所建立的一测多评法测定23批洋常春藤及30批提取物中4个皂苷类成分含量并比较两者的差异,以评价"一测多评"法的准确性。结果:23批洋常春藤中α-常春藤素、常春藤皂苷B、常春藤萜苷D的"一测多评"法测得含量与外标法结果之比分别为(100.56±0.29)%、(99.37±0.32)%、(99.52±0.18)%,30批提取物中相应成分2种方法的比值分别为(100.86±0.87)%、(99.84±0.02)%、(99.84±0.03)%;药材及提取物中2种方法所对应上述皂苷成分的相对偏差RE分别在0.10%~3.28%、0.12%~1.53%、0.11%~0.83%之间;3个常春藤皂苷的相对校正因子在不同仪器、不同色谱柱、不同检测波长、不同柱温及不同流速下的RSD分别为1.1%~3.6%、1.6%~2.0%、0.47%~3.1%、1.5%~2.9%与0.55%~2.5%,耐用性良好。结论:本文所建常春藤皂苷成分同时定量的一测多评方法准确度高、重复性及耐用性好,可用于洋常春藤及其提取物质量的常规检验与快速分析。

洋常春藤及其栽培品种的HPLC-UV指纹图谱和质量评价研究

目的通过建立洋常春藤及其栽培品种中皂苷类化合物的HPLC-UV指纹图谱,采用聚类分析和主成分分析方法进行统计学分析研究,同时结合标定化合物的测定,以期为常春藤属植物的药用质量评价提供参考。方法 Unitary C18色谱柱（250mm×4.6 mm,5μm）;流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）;二元高压梯度洗脱;检测波长205 nm;体积流量1 m L/min;进样量20μL;柱温25℃。结果采用＂中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A）＂标定了17份常春藤属样品的12个共有指纹峰,计算其相似度在0.715～0.992;通过聚类分析和主成分分析结果初步判断洋常春藤的综合药用质量要优于其他品种。结论建立的方法能够成功应用于筛选高质量的常春藤原料以及进行洋常春藤及其栽培品种药材的质量评价与控制,同时可为制定洋常春藤及其栽培品种药用质量评价研究提供新的参考依据。

洋常春藤HMGS基因克隆与表达分析

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶（HMGS）是MVA途径中的关键酶基因,其作用主要是催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-Co A）。为分析洋常春藤HMGS基因在常春藤皂苷生物合成途径中的功能及调控机制,本研究利用RACE克隆技术克隆获得了洋常春藤HMGS基因c DNA全长序列并进行了生物信息学分析。结果表明：洋常春藤HMGS基因的c DNA全长1 751bp,命名为Hh HMGS（Gen Bank登录号：KX056075）,其包含编码468个氨基酸的开放阅读框。预测该基因编码的蛋白质分子量为52.0 k D,理论等电点为5.99。氨基酸序列比对结果表明,洋常春藤中的HMGS与人参的HMGS同源性最高,达到95%。通过RT-q PCR分析Hh HMGS基因在洋常春藤中的时空表达规律,结果表明Hh HMGS基因与常春藤皂苷含量之间并未呈现出相关性。本研究为探讨HMGS基因在常春藤皂苷生物合成途径中的作用以及深入的研究该基因的分子调控机制奠定基础。

洋常春藤β-AS基因的全长克隆与表达分析

β-香树素合成酶(β-AS)是三萜皂苷生物合成途径中关键酶基因,可以催化形成齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的骨架结构。本研究利用RACE克隆技术克隆并分析了洋常春藤中的β-AS基因,结果表明:洋常春藤β-AS基因的c DNA全长2784 bp,命名为Hhβ-AS(Gen Bank登录号:KU942522),其包含编码763个氨基酸的开放阅读框。预测该基因编码的蛋白质分子量为87.8 k D,理论等电点为5.94。经过氨基酸序列比对,结果表明洋常春藤中的β-AS与刺楸的β-AS同源性最高,达到96%。通过RT-q PCR分析Hhβ-AS基因在洋常春藤中的时空表达规律,表明Hhβ-AS基因与常春藤皂苷含量之间存在明显的正相关性,为探讨其在常春藤皂苷生物合成途径中的作用以及深入的研究该基因的分子调控机制奠定基础。

洋常春藤鲨烯合成酶基因HhSS的克隆与表达分析

目的克隆获得洋常春藤Hedera helix鲨烯合成酶基因(HhSS)cDNA全长序列并进行生物信息学分析及表达分析。方法根据洋常春藤转录组数据信息设计引物,通过RACE克隆方法获得HhSS基因序列;采用DNAMAN、PROTPARAM、TMHMM、PSORT、Scan Prosite、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学工具分析序列信息及编码蛋白的理化特性、结构域等特征;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术进行HhSS基因的检测分析。结果 RACE克隆获得HhSS(Gen Bank登录号KX056078)基因cDNA序列全长1 889 bp,包含一个从248~1 477 bp的完整开放阅读框(ORF)以及247 bp的5’非编码区(5’UTR)和412 bp的3’非编码区(3’UTR)。该基因编码409个氨基酸,相对分子质量为46 800,等电点为5.68。HhSS蛋白具有植物SS蛋白的特征结构域和跨膜区,与刺五加、人参等同科植物亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明洋常春藤叶片中HhSS基因的相对表达量与常春藤皂苷含量存在正相关性。结论洋常春藤HhSS基因的成功克隆及表达分析研究,为阐明HhSS基因在常春藤皂苷生物合成途径中的作用及代谢调控研究提供理论依据和技术基础。