应用活体冷冻技术研究活体小鼠心脏微循环

目的:分别用传统组织制备方法与活体冷冻技术(in vivo cryotechnique,IVCT)联合冷冻置换制备方法制备样本,对比研究小鼠心外膜下微循环内血流、红细胞及血清蛋白在心脏的免疫定位分布。方法:实验分三组,活体冷冻组(IVCT)、浸泡固定组(immersion dehydration fixation,IM-DH)及灌流固定组(perfusion dehydration fixation,PF-DH),每组8只小鼠,分别对跳动的小鼠心脏进行活体冷冻技术联合冷冻置换,浸泡固定及灌流固定,制作的组织样本分别进行苏木素-伊红染色、免疫组织化学染色以及双重免疫荧光染色,光镜及共聚焦荧光显微镜观察,对结果进行对比分析。结果:IVCT从组织形态学水平显示微血管内流动状态的血流,即单行排列的顶端指向血流方向的成串的降落伞型红细胞,以及微血管分流和汇合处;血清白蛋白和免疫球蛋白不但通过微血管壁进入细胞间隙,白蛋白还单独分布在心肌细胞间的特殊结构闰盘和心肌细胞表面的T小管。结论:IVCT实现了从免疫组织化学水平显示活体状态小鼠心脏的微循环;心肌细胞间的闰盘及心肌细胞表面的T小管对血清蛋白具有分子大小选择性。

应用活体冷冻技术动态观察各种血流动力学改变时血清白蛋白在小鼠近端肾小管的分布变化

目的应用活体冷冻技术结合免疫组织化学的方法形象化表现各种血流动力学条件下小鼠血清白蛋白经肾小球毛细血管袢滤过后,在近曲小管再吸收的病理生理过程。方法分别在正常血流、急性高血压和心脏骤停等血流动力学条件下,对模型小鼠的左肾进行活体冷冻及冷冻置换。连续的石蜡切片后,分别进行苏木精-伊红染色和抗小鼠白蛋白抗体免疫组织化学染色。结果正常血压和心脏骤停情况下,血清白蛋白在血管内清晰定位,少量出现在近端小管顶端的细胞质部分,但在急性高血压情况下,血清白蛋白明显地免疫定位于所有近端小管。结论活体冷冻技术结合冷冻置换方法可以原位捕获瞬间被活体功能状态的近端肾小管上皮细胞再吸收的血清白蛋白,可视化活体组织细胞的功能形态学特征。

应用活体冷冻技术分析急性高血压时免疫球蛋白G在小鼠近端肾小管中的分布变化

目的应用活体冷冻技术结合免疫组织化学方法形象化地研究急性高血压血流动力学条件下,小鼠免疫球蛋白G(IgG)及其轻、重链经肾小球毛细血管袢滤过后,在近端小管再吸收的病理过程。方法分别在正常血流、急性高血压和心脏骤停等血流动力学条件下,进行小鼠肾脏活体冷冻及冷冻置换。连续的石蜡切片后,分别进行苏木精-伊红(H-E)染色和IgG、kappa轻链和IgG1重链免疫组织化学染色。结果正常血压和心脏骤停情况下,IgG在血管内清晰定位,只有极少量出现在近端小管顶端的细胞质内。而在急性高血压情况下,kappa轻链几乎免疫定位于所有近端小管,无IgG1重链表达。并首次展示了小鼠活体内血清IgG的轻链而非重链通过肾小球滤过后,迁移至近端肾小管重吸收的过程。结论活体冷冻技术结合冷冻置换方法能够原位瞬间捕获不同血流动力学条件下血清IgG在活体肾组织中的分布状态,可视化活体组织细胞的功能形态学特征。

活体冷冻技术在评估小鼠心脏缺血再灌注损伤中的应用

目的:探讨活体冷冻技术在评估小鼠心脏缺血再灌注损伤中的应用。方法:将36只小鼠随机分为假手术组(C组)、缺血组(I组)、再灌注0 min组(I/R 0 min组)、再灌注15 min组(I/R 15 min组)、再灌注1 h组(I/R 1 h组)、再灌注前2 h阿托伐他汀10 mg·kg-1灌胃组(A102组)、再灌注前2 h阿托伐他汀20 mg·kg-1灌胃组(A202组)、再灌注前12 h阿托伐他汀20 mg·kg-1灌胃组(A2012组)、再灌注前2 h阿托伐他汀20 mg·kg-1灌胃+再灌注前15 min L-NAME(N-硝基-L-精氨酸甲酯)15 mg·kg-1尾静脉注射组(AL202组)等9组,每组均4只小鼠。于光镜下结扎冠状动脉制备心肌缺血再灌注模型,均以活体冷冻技术(in vivo cryotechnique,IVCT)摘取心脏后行冷冻置换、石蜡包埋,之后切片进行HE染色及Albumin免疫组织化学染色,并对间质中的Albumin免疫组织化学染色强度进行半定量分析。结果:(1)相比C组,I组可见心肌微血管内红细胞明显减少或缺如,心肌细胞肿胀,Albumin向间隙内明显渗出。I/R 0 min组血流恢复情况尚可,Albumin无明显向间质等部位渗漏;I/R 15 min组及I/R 1 h组可见随再灌注时间的延长,心肌细胞及微血管内红细胞形态渐趋肿胀、紊乱、破碎,Albumin向间隙内的渗漏明显增多。(2)与I/R 1 h组相比,A202组心肌细胞界限较清晰,微血管内红细胞形态正常,Albumin无明显向间质等部位渗漏。A102组及A2012组镜下所见与A202组类似,但微血管内红细胞形态及心肌细胞界限、Albumin向间质的渗漏程度等不及A202组。AL202组可见心肌细胞肿胀,微血管内红细胞减少、缺如,但微循环血流及Albumin渗漏情况仍优于I/R组。结论:应用IVCT可直观评估小鼠缺血及再灌注过程中心脏微循环状态及微血管渗透性变化。再灌注前2 h应用阿托他汀强化治疗可改善缺血再灌注心脏微循环状态及微血管渗透性。

裸鼠肺腺癌移植瘤组织中缺氧诱导因子-1α蛋白、血清蛋白和淋巴管内皮细胞透明质酸受体1蛋白表达及意义

目的:回顾性研究肺腺癌移植瘤裸鼠模型组织中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血清蛋白[Albumin、免疫球蛋白M(IgM)]和淋巴管内皮细胞透明质酸受体1(LYVE-1)蛋白表达及意义。方法:在裸鼠背部皮下注射肺腺癌A549细胞,建立移植瘤模型。利用活体冷冻技术(IVCT)制备标本,采用HE染色及免疫组织化学(IHC)染色分析HIF-1α、Albumin、IgM和LYVE-1蛋白的表达。结果:在A549移植瘤细胞中HIF-1α蛋白表达呈阴性。肺腺癌侵袭组织中Albumin和IgM蛋白呈阳性的功能血管密度高于非侵袭组织[(14.80±1.03)个/高倍视野(HPF)与(3.50±0.53)个/HPF,P<0.01]。肺腺癌侵袭组织中LYVE-1蛋白呈阳性的淋巴管密度高于非侵袭组织[(25.90±4.43)个/HPF与(3.60±0.52)个/HPF,P<0.01]。结论:HIF-1α蛋白表达与肺腺癌侵袭和功能性血管、淋巴管密度无关,但是功能性血管和淋巴管密度与肺腺癌的侵袭、发展密切相关。

阿托伐他汀预处理对缺血再灌注小鼠心肌微血管内皮屏障的保护作用

目的:探讨阿托伐他汀预处理对缺血再灌注小鼠心肌微血管血流灌注和渗透性的作用及其机制。方法:60只昆明小鼠随机分为6组:假手术组(C组)、缺血组(I组)、再灌注组(I/R组)、再灌注前2h阿托伐他汀10mg/kg灌胃组(A102组)、再灌注前2h阿托伐他汀20mg/kg灌胃组(A202组)、再灌注前2h阿托伐他汀20mg/kg灌胃+再灌注前15min L-NAME(N-硝基-L-精氨酸甲酯)15mg/kg尾静脉注射组(AL202组),每组均10只小鼠。于光镜下结扎冠脉制备心肌缺血再灌注模型,以活体冷冻技术(IVCT)摘取心脏,其中5只小鼠心脏行冷冻置换、石蜡包埋,之后切片行HE染色及Albumin免疫组织化学染色,并对间质中的Albumin免疫组织化学染色强度进行半定量分析;另5只小鼠采用Western Blotting检测心肌组织内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、黏附连接蛋白VE-cadherin和紧密连接蛋白Claudin-5的表达水平。结果:与I组及I/R组相比,A202组小鼠心肌细胞界限较清晰,降落伞型红细胞的顶端指向血流方向,Albumin无明显向间质等部位渗漏。A102组镜下所见与A202组类似,但微血管内红细胞数量、形态及心肌细胞界限清晰度等不及A202组,Albumin向间质渗漏。AL202组可见心肌细胞肿胀,微血管内红细胞减少、缺如,但微循环血流灌注好于I/R组,Albumin渗漏少于I/R组。与I组和I/R组对比,A202组和A102组心肌组织中eNOS蛋白表达均明显升高(P<0.01),尤以A202组最为明显(P<0.05)。与A202组相比,AL202组eNOS蛋白表达降低(P<0.05),且与I/R组差异无统计学意义(P>0.05)。与C组相比,I组和I/R组VE-cadherin蛋白和Claudin-5蛋白表达显著降低(P<0.05),而A102和A202组VE-cadherin蛋白和Claudin-5蛋白表达较I组和I/R组明显升高(P<0.05),尤以A202组升高最为明显(P<0.05)。AL202组VEcadherin及Claudin-5蛋白水平较I/R组升高(P<0.05)。结论:再灌注前短时间内大剂量阿托伐他汀预处理可改善缺血再灌注心肌微循环血流灌注及微血管渗透性,其机制可能不完全依赖于eNOS/NO途径。

非小细胞肺癌移植瘤侵袭组织中血清蛋白的分布

目的:局部侵袭是肺癌患者死亡的主要原因之一,本研究探讨肺癌侵袭组织中血清蛋白的分布及其与血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)蛋白的关系。方法:建立非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞注射裸鼠背部皮下的异种移植模型,利用活体冷冻技术(IVCT)制备标本,免疫组化分析Albumin、Ig G、Ig M、VEGF、EGFR蛋白分布。结果:观察到NSCLC侵袭组织周围结缔组织、血管、间质及细胞外基质有Albumin和Ig G1、Ig M主要在侵袭组织周围结缔组织和血管内,癌细胞外基质未观察到Ig M。肺癌细胞浆内VEGF蛋白呈细颗粒状,但是癌细胞浆和膜未观察到EGFR蛋白分布。结论:利用IVCT技术能清晰观察到侵袭组织周围结缔组织、血管和细胞外基质中不同分子量血清蛋白分布,NSCLC侵袭组织细胞外基质Albumin、Ig G1和Ig M免疫组织化学染色分布主要依据其分子量,与VEGF和EGFR蛋白分布无关。

大细胞肺癌移植瘤组织中HIF-1α、VEGF、Ki67、血清蛋白的表达及其与功能性血管数目的关系

目的:研究大细胞肺癌(LCLC)Lu65和Lu99细胞株裸鼠移植瘤组织中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、Ki67以及血清蛋白Albumin、IgG1、IgM的表达,及其与功能性血管数目的关系。方法:将大细胞肺癌Lu65和Lu99细胞注射至裸鼠背部皮下建立异种移植模型,利用活体冷冻技术(IVCT)制备标本,免疫组织化学法分析移植瘤侵袭组织中HIF-1α、VEGF、Ki67和血清蛋白(Albumin、IgG1、IgM)的表达,根据血管周围细胞外基质内IgM蛋白的表达情况区分功能性血管和非功能性血管并分别计数,采用t检验、χ^(2)检验及Spearman秩相关分析进行统计学分析。结果:Lu65移植瘤中可见少数肿瘤细胞核中有HIF-1α蛋白表达,Lu99移植瘤细胞核中未见HIF-1α蛋白表达,二者差异有统计学意义(P<0.05);两种移植瘤组织中VEGF和Ki67蛋白均呈高表达。HIF-1α蛋白表达水平与VEGF和Ki67蛋白无明显相关(P>0.05)。Lu65和Lu99移植瘤组织内功能性血管数目高于非功能性血管(P<0.05)。结论:Lu65和Lu99移植瘤组织中HIF-1α蛋白表达水平与VEGF、Ki67蛋白无明显相关,与细胞异质性有关。IVCT技术制备的组织标本可区分功能性血管与非功能性血管,Lu65和Lu99移植瘤组织中功能性血管数目高于非功能性血管,血清蛋白能否透过血管壁可能与其相对分子质量和血管结构有关。