活体生物萤光成像技术新进展

活体生物萤光成像技术(in vivo biolumines- cence imaging)是近年来发展起来的一项崭新的分子、基因表达的分析检测系统．与传统的检测方法相比具有巨大的优越性,堪称是分子基因检测领域的革命性技术．随着萤光成像设备的进一步完善以及转基因动物的构建开发,在欧美等发达国家活体生物萤光成像技术已被广泛地应用于感染、肿瘤免疫及治疗、自身免疫性疾病、器官移植、基因治疗、药物开发等实验领域．本文就活体生物萤光成像技术的发展和应用作如下综述．

小动物活体生物发光成像技术在肿瘤转移研究中的应用

建立小动物活体生物发光成像技术,研究三氧化二砷(As2O3)抑制小鼠B16恶性黑色素瘤的肺转移作用的方法,比较活体生物发光成像技术与常规动物实验技术的优劣性;并探讨As2O3抗小鼠恶性黑色素瘤肺转移的可能机制。结果表明,活体生物发光成像技术可以非侵袭性地动态监测黑色素瘤B16细胞在小鼠肺部的转移过程以及评估As2O3的体内抑制B16肺转移的作用,且活体生物发光成像技术的检测灵敏度优于传统肺转移瘤结节计数技术;As2O3主要通过减低肿瘤新生血管形成、促使肿瘤组织坏死而发挥抗小鼠黑色素瘤肺转移的作用。

活体生物发光与荧光成像技术在干细胞研究中的应用

活体生物发光与荧光成像技术是近年发展起来的新兴技术,以其操作简便、灵敏度高、创伤性小在生命科学研究中有着较大的优势,目前已被广泛应用于基因标记、细胞凋亡、免疫细胞研究、肿瘤转移等诸多领域,尤其在新兴的干细胞研究方面更是发挥着不可替代的作用。综述了活体生物发光与荧光成像技术的原理、优势、应用范围及发展前景,特别对近年来该技术在胚胎干细胞的肝向分化、人造血干细胞重建小鼠造血系统、神经祖细胞治疗中枢神经系统肿瘤等方面的应用做了详细介绍。

稀土纳米材料在高分辨活体成像及诊疗中的应用

荧光成像具有时空分辨率高、反馈快、非侵入和无电离辐射等优点,是一种重要的生物成像技术.与传统用于荧光成像的可见光和近红外一区(NIR-I,600~950 nm)相比,近红外二区(NIR-Ⅱ,1000~1700 nm)窗口具有低生物组织散射系数和低生物自发荧光,采用NIR-Ⅱ光进行活体荧光成像能有效提高成像的分辨率、信噪比和穿透深度.稀土纳米颗粒(RENPs)具有大斯托克斯位移、高化学稳定性、可调的荧光寿命以及较窄的发射带,是一种重要的荧光成像探针.近年来,一系列具有优异的NIR-Ⅱ发光性能的稀土纳米材料被用于高分辨活体荧光成像.本文综合评述了近年来RENPs用于高分辨活体成像及诊疗中的研究进展,概述了RENPs的掺杂调控、基质晶格选择和复合敏化等NIR-Ⅱ发光增强策略,介绍了其在多种生物医学场景中的靶向聚集、荧光传感和疾病治疗等功能,并总结了其在多路成像、多模态成像和疾病诊疗中的应用.最后,简要分析了RENPs在未来生物医学应用中面临的挑战和发展的方向.

用于活体成像的人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系的构建

目的构建能稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系以建立可用于活体成像的三阴性乳腺癌裸鼠移植瘤模型。方法采用磷酸钙共沉淀的方法构建表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,体外感染MDA-MB-231细胞,经G418筛选得到稳定细胞系后,通过活体成像评价感染后细胞表达荧光素酶的情况,并通过MTT法、transwell肿瘤侵袭模型、细胞划痕实验等评价细胞的增殖、侵袭及转移能力是否改变;此外将细胞接种至雌性BALB/c-nu//nu裸小鼠的右侧第2对乳房垫内,构建乳腺癌原位肿瘤模型。利用活体成像系统监测体内肿瘤的生长及转移情况,并通过冰冻切片、HE染色评价细胞系在活体内的稳定性及成瘤能力。结果成功构建能稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的MDA-MB-231细胞系,荧光素酶的活性达到每细胞9689 photons/s,慢病毒的整合没有改变细胞的增殖、迁移及侵袭能力;成功建立了乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型。结论(1)慢病毒以其高效稳定的感染率,应作为标记荧光素酶基因的首选载体;(2)带有荧光素酶的MDA-MB-231细胞在动物体内可被快速而灵敏的检测到,这将为人三阴性乳腺癌转移机制的研究及抗肿瘤药物的研发提供一个直观、方便及灵敏的平台;(3)荧光素酶和荧光蛋白基因双标记优于单标记。

应用活体生物发光成像技术对纳米雄黄抗小鼠乳腺癌肝肺转移作用的研究

为研究雄黄纳米颗粒的体内抗小鼠乳腺癌肺转移和肝转移作用,以萤火虫荧光素酶(luciferase,Luc)基因标记小鼠4T1乳腺癌细胞(4T1-Luc),给BALB/c小鼠尾静脉注射4T1-Luc细胞制作小鼠乳腺癌肺和肝转移瘤模型,纳米雄黄[5mg/(kg·d)和10mg/(kg·d)]灌胃治疗32d,采用小动物活体生物发光成像系统动态观察乳腺癌细胞的转移情况。治疗末期处死动物,取出肺和肝,立即置活体生物发光成像系统下进行成像,然后肉眼观察肺和肝表面转移瘤结节形成并计数;肺、肝组织制片、HE染色,光镜下观察组织形态变化。结果显示,体内纳米雄黄可显著抑制小鼠乳腺癌细胞在肺和肝中的转移(P<0.05),纳米雄黄治疗组小鼠的肺转移瘤结节和肝微转移灶体积小且数量少。上述结果证实,纳米雄黄可有效抑制小鼠乳腺癌4T1-Luc细胞的肺转移和肝转移能力;活体生物发光成像技术应用于活体肿瘤转移研究较常规动物实验技术具有更高的灵敏性。

应用生物发光活体成像技术进行抗肿瘤研究进展

生物发光活体成像技术是基于荧光素酶报告系统进行小动物组织、细胞和分子体内行为研究的新兴生命科学技术,在抗肿瘤研究领域应用极为广泛。全文概述生物发光活体成像技术的原理、综述了生物发光活体成像在抗肿瘤研究方面应用的最新进展以及发展趋势,为应用该技术进行抗肿瘤领域研究提供参考。

活体生物荧光成像技术检测HO-1在HO-1／Luc小鼠肝脏缺血模型中的表达

目的尝试使用活体生物荧光成像技术无创定量检测HO-1在活体动物肝脏温缺血模型中的时空表达。方法建立小鼠部分肝脏温缺血模型，使用活体生物荧光成像技术连续检测HO-1在HO-1／Luc转基因报告小鼠中的转录情况。使用RT-PCR方法检测HO-1 mRNA水平，免疫组织化学方法行HO-1的表达定位。结果缺血肝叶发出的荧光信号最早于再灌注后3h被检测到，随后信号不断增强在9h达到峰值，然后信号逐渐减弱至再灌注后48h恢复至基础水平。RT-PCR方法测得在HO-1蛋白上调之前出现了HO-1mRNA的表达增强。免疫组织化学染色方法证实肝脏细胞是缺血再灌注损伤后HO-1表达上调的主要部位。结论活体生物荧光成像技术可以实时定量检测肝脏缺血后HO-1的表达，是一项敏感的检测技术。

血小板低下对树突状细胞在体迁移与归巢模式的影响研究

目的:探讨血小板低下对过继性树突状细胞(DC)在体内迁移模式的影响。方法:腹腔注射抗CD41单克隆抗体以建立血小板低下小鼠模型。将带报告基因的骨髓来源DC经脚垫和静脉两种途径输注至血小板低下和正常小鼠体内,用活体成像技术监测DC在小鼠体内的迁移和组织内分布情况。结果:经抗GPⅡb抗体处理组小鼠体内80%以上血小板被清除。DC经脚垫回输72 h后,在血小板低下组迁移到腘窝淋巴结(PLN)和腹股沟淋巴结(ILN)的比例分别为(0.32±0.02)%和(0.02±0.01)%;对照组上述两部位内为(0.27±0.15)%和(0.02±0.02)%。两组之间无统计学差异(P>0.05)。经静脉输注DC 72 h后,血小板低下组和对照组小鼠组织内的分布均主要集中在脾脏、肝脏引流淋巴结、肺脏和肝脏等,且分布比例无统计学差异。结论:小鼠体内血小板低下至不足20%时,对经皮下和静脉两种途径输注的DC在体内迁移和组织分布无明显影响。

近红外二区共聚焦显微技术的进展及应用(特邀)

共聚焦显微镜具有较高的空间分辨率和信号背景比,能对生物样品进行三维层析成像,在医学与生物学领域有着广泛的应用。近红外二区(NIR-Ⅱ,900~1 880 nm)波段的光在生物组织中具有适中的吸收、较低的散射,以及非常弱的生物组织自发荧光,因此,NIR-Ⅱ荧光活体成像具有大深度、高对比度等优势。点激发、点探测的NIR-Ⅱ共聚焦显微技术结合了上述二者的优势,在大深度生物成像中具有高空间分辨率和高信号背景比等优点,因此在生物医学领域得到了广泛应用。此综述将从NIRⅡ共聚焦显微技术的原理出发,阐述其发展进程、以及基于此项技术开展的生物医学成像应用,探讨NIR-Ⅱ共聚焦显微技术未来的改进和发展方向。

自适应光学在生物荧光显微成像技术中的应用

显微成像是开展微观生命科学研究的重要手段,其中荧光显微成像以其可特异性标记、暗场对比度高、动态示踪性能出色等优势在生物成像领域占据重要地位.由于活体生物组织通常是非透明、非均匀、各向异性的复杂三维结构,激发光和发射荧光在生物组织内传播时均会由于折射、散射、吸收等作用使得光波波前发生明显畸变,造成激发光点扩散函数以及荧光成像点扩散函数的性能显著降低.借助自适应光学技术可对上述经由生物组织传播产生的波前畸变进行实时探测和精确校正,从而提升激发光照明和发射荧光成像的空间分辨率和深度.本文归纳了生物荧光显微成像中的不同像差来源,介绍了自适应光学波前传感和校正的方法,概括了不同成像方式下波前校正的要求,重点讨论了自适应光学技术在不同类型荧光显微成像中的运用和实现方法,并对其今后的应用目标和发展方向提出展望.

MKN-45人胃癌原位移植模型的建立及紫杉醇在该模型中的疗效评价

目的建立可实时监测的人胃癌原位移植瘤模型,并利用活体成像系统可视化评价紫杉醇在该模型中的疗效。方法按照皮下成瘤-传代-原位移植的模式,采用原位移植技术将组织学完整的、稳定表达荧光素酶的人胃癌细胞MKN-45-luc移植至BALB/c(nu/nu)裸鼠胃壁浆膜下,术后第7、14天对小鼠进行活体成像,评价肿瘤原位移植模型的建立。成模裸鼠尾静脉注射紫杉醇(10 mg/kg)1次,活体成像观察小鼠肿瘤生长,记录小鼠体重变化与生存曲线。26 d后对小鼠移植瘤及转移瘤取材,苏木精-伊红(HE)染色观察肿瘤形态学特征,侵袭范围及转移情况。结果MKN-45-luc的细胞形态及对紫杉醇的敏感性与MKN-45差异无统计意义(P>0.05)。成功建立人胃癌原位移植模型,成瘤率为90%(18/20),小鼠出现淋巴结转移和肝脏转移,病理HE切片符合胃癌组织学特征。与对照组比较,成模小鼠紫杉醇给药后抑瘤效果明显。结论胃囊-OB胶法简便、高效,建立的胃癌原位移植模型与人胃癌生物学特征更相似。

细胞因子诱导的杀伤细胞对人宫颈癌HeLa-luc细胞荷瘤裸鼠模型的抗肿瘤作用

目的:探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)抗肿瘤活性,及其作用机制。方法:人宫颈癌细胞HeLa-luc接种BALB/C裸鼠建立动物模型。从健康人外周血单个核细胞诱导培养CIK细胞。CIK或PBS经瘤周注射入荷瘤鼠体内。应用活体生物发光成像技术观察肿瘤大小变化。观察肿瘤的体积和重量变化。ELISA法检测荷瘤鼠外周血中IFN-γ水平。HE染色观察肿瘤、肺脏、肝脏及脾脏的病理形态学变化。结果:CIK治疗后实验组(CIK)肿瘤明显比对照组(PBS)体积小,P<0.05。接种HeLa-luc细胞第5、8周的抑瘤率分别为47.18%、64.38%。接种HeLa-luc细胞第8周实验组血清中IFN-γ〔(61.92±6.49)ρg/mL〕明显高于对照组〔(34.30±1.78)ρg/mL〕,P<0.01。实验组和对照组中,肿瘤组织形态学无明显差别。实验组肺脏、肝脏未见癌结节出现,但均有炎细胞浸润。对照组肺脏出现大量癌结节而肝脏未见癌结节出现。两组脾脏中均可见癌结节。结论:CIK细胞可以明显抑制肿瘤的生长,其机制可能与免疫细胞产生IFN-γ有关。该研究为肿瘤的临床过继免疫治疗提供了理论依据。

奥拉帕尼对Taxol抗乳腺癌4T1的增敏作用

聚ADP-核糖聚合酶1/2(PARP1/2,poly ADP-ribose polymerase1/2)能催化底物蛋白的多聚ADP-核糖化(PAR)修饰,在细胞DNA损伤修复、细胞死亡和转录调节中具有重要调控功能。其抑制剂奥拉帕尼(olaparib,AZD2281)可作为放化疗增敏剂,能够在多种肿瘤的放化疗中发挥较好的增敏作用。通过建立生物荧光标记的体内4T1异位乳腺肿瘤模型,研究奥拉帕尼对于小鼠乳腺癌4T1细胞的体内外单药抗肿瘤和对紫杉醇(Taxol)的增敏活性。实验结果表明,单独使用AZD2281对4T1肿瘤的治疗作用较差(包括体外MTT和流式实验,体内荷瘤小鼠实验),而在联合Taxol使用时,能显著增敏Taxol的抗肿瘤作用,并降低肿瘤组织的PAR水平,且没有明显增加化疗药物的毒性。此研究证实了以奥拉帕尼为代表的PARP抑制剂可以在小鼠乳腺癌4T1异位模型上增敏化疗药物Taxol的作用,为下一步研究其作用机制奠定了基础。

绿色荧光蛋白与荧光素酶双标记肝癌细胞的构建及其在小鼠模型中的应用

目的构建绿色荧光蛋白(GFP)与萤火虫荧光素酶(FLuc)双标记的人肝癌HepG2细胞株(HepG2-GL),并应用于小鼠模型与活体生物发光成像。方法通过慢病毒感染、嘌呤霉素筛选、流式细胞分选和单克隆扩增构建HepG2-GL细胞株,并将其接种至BALB/c裸鼠皮下或静脉内,建立皮下移植瘤模型与血行性转移瘤模型,应用小动物活体成像系统示踪肿瘤。结果荧光显微镜下可观察到80%以上的HepG2-GL细胞发出绿色荧光;荧光素酶检测实验中HepG2-GL组的平均发光强度为3.2×10^(4)counts/s,远高于HepG2组,差异有统计学意义(t=65.99,P<0.05);HepG2-GL细胞接种至小鼠皮下28 d后增殖形成体积达274或690 mm^(3)的肿瘤块,接种至小鼠静脉内16 d后转移定植于小鼠肺、骨和头颈部;两类肿瘤模型小鼠在观察终点的活体生物发光信号均较接种肿瘤后当天明显增强,且信号强弱分布情况与HepG2-GL细胞在小鼠体内的空间分布密切相关。结论成功构建HepG2-GL细胞株并应用于小鼠模型,活体生物发光成像可实现对肿瘤生长与转移的良好监测。