活体电穿孔法基因导入技术

活体电穿孔法 (invivoelectroporation)可将外源基因有效导入靶组织或器官 ,导入效率较高 ,并且可在多种组织器官上应用。近年来活体电穿孔法用于转基因研究的报道不断增多 ,在基因治疗方面的优势也日趋显著 。

活体电穿孔法辅助HE4基因免疫小鼠制备单克隆抗体

目的：采用电穿孔辅助DNA免疫方法制备小鼠抗人附睾蛋白4（HFA）单克隆抗体（mAb）并对其生物学特性进行鉴定。方法：利用逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）从卵巢癌患者组织中获得人HFA基因编码序列，将其亚克隆至pPICZαA表达载体中并测序鉴定。采用活体电穿孔法免疫BALB／c小鼠。单抗制备采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，经多次克隆化培养，筛选出特异分泌鼠抗人HFAmAb的杂交瘤细胞株。采用Westernblot，Ig亚型分析和mAb表位分析等对mAb的生物学特性进行鉴定。结果：获得2株持续、稳定分泌鼠抗人I-IFAmAb的杂交瘤细胞株，命名为1—7-C和3-12-C。ELISA和Westernblot结果均显示本实验获得的2株mAb能够特异识别有天然构象的HFA蛋白，2株mAb的Ig亚类均为IgM，轻链均为入链。结论：成功地构建了pPICZαA-HE4表达载体，并获得2株鼠抗人HFA杂交瘤，其所分泌的抗体能特异地识别HFA蛋白。

活体电穿孔方法提高外源GRF基因在小鼠肌肉组织中的表达

向小鼠后肢小腿肌注pGRF表达质粒并加以电穿孔条件,注射剂量分别为5,10,50μg,于注射前及注射后10,20,30d测体质量,并采血分离血清测血清GRF水平。结果显示,5μgpGRF质粒电穿孔组注射后10dGRF分别比对照组、5μgpGRF质粒组升高44.73%(P<0.05),12.86%(P>0.05);血清中GRF水平升高。30d累积增重,5μgpGRF质粒电穿孔组分别比对照组、5μgpGRF质粒组高11.46%,6.75%(P>0.05);10μgpGRF质粒组分别比对照组和10μgpGRF质粒电穿孔组高19.52%(P>0.05),19.42%(P>0.05)。50μgpGRF质粒组45d累积增重分别比对照组、pGRF质粒电穿孔组高14.00%,12.00%(P>0.05)。结果表明,电穿孔处理可提高GRF基因在小鼠肌肉中的表达。

抗辐射球菌pprI基因活体电转染对受照小鼠睾丸病理学作用的研究

观察抗辐射球菌pprI基因活体电转染小鼠受γ射线辐照后睾丸组织的形态学变化,探讨一种新的原核基因表达对哺乳动物生殖系统损伤的防治作用。将含有pprI基因的pCMV-HA-pprI质粒注入小鼠肌肉内,然后采用活体基因电转染技术将该基因导入细胞内,对照组小鼠和转基因组小鼠均采用60Coγ射线全身照射,吸收剂量为6 Gy,分别于辐照后第1、7、14、28和35天取下注射部位肌肉组织,提取组织总蛋白,进行PprI蛋白的Western blotting检测。同时取小鼠睾丸组织,石蜡包埋制片,苏木精-伊红染色,进行镜下病理学观察。PprI蛋白在辐照后第1天有较强的表达,说明pprI质粒成功转染至小鼠体内。对照组小鼠在照后第1天生精小管结构完整,各级生精细胞未见明显病理变化;第7天在部分生精小管观察到少量精原细胞坏死;第14天生精细胞变性坏死明显加重,生精小管萎缩变细,相互"远离";至第28天各级生精细胞及精子极度减少,生精小管内细胞分层结构基本消失,甚至空虚,仅残留支持细胞,间质疏松;第35天空虚的生精小管内开始出现新生精原细胞。而转基因组小鼠辐照后第1天生精细胞未见明显病理变化;第7天部分生精小管见少量精原细胞坏死,较单纯照射组轻;第14天生精细胞变性坏死加重,各级生精细胞数量减少;第28天局部生精小管内出现新生精原细胞,基底层结构基本显现;第35天转基因组局部生精小管内新生生精细胞增多,出现分层现象。研究结果表明,pprI基因活体电转染对小鼠睾丸γ辐射损伤具有显著的防治作用,睾丸辐射损伤修复明显提前。