应用鸡胚活体电转GFP示踪技术观察脊髓左右两侧神经元纤维投射

目的:探索鸡胚发育过程中,脊髓左右侧神经元经纤维之间的联系,为脊髓两侧神经纤维投射提供形态学基础;方法:采用鸡胚带壳开窗培养技术,待胚胎发育至第3天,通过活体电转基因,将pCAGGS-GFP质粒0.1～0.5μl准确注射到脊柱,在电压18 V、每次脉冲60 ms,间隔100 ms,电脉冲6次的条件下进行定时定位活体电转基因,电转后6小时开始到10天,分别收集胚胎,甲醛固定冰冻切片,DAPI染细胞核观察组织形态结构变化。结果:电转后6小时便可以观察到GFP的表达,24小时后可以看到GFP标记细胞纤维的投射,3天可以清晰的观察到转入GFP一侧脊髓的运动神经元纤维束投射到另外一侧脊髓。结论:电转GFP成功标记运动神经元纤维在脊髓左右两侧的投射。

鸡胚培养及活体电转基因方法的建立

目的建立和优化鸡胚胎带壳培养(in ovo culture)、去壳培养(ex ovo culture)和活体原位电转基因(in vivo electroporation)等技术。方法鸡胚孵化第2～3天,带壳培养至2～3 d和去壳培养至5～6d,分别在脊髓和大脑视顶部位,在电压18V、电流60mA、间隔90ms和电脉冲6次(60ms/次)的条件下进行定时定位活体电转基因。结果带壳和去壳培养样本数分别为20个和10个,成活率分别是85%和80%,胚胎发育至2～3 d和5～6 d在脊髓和视顶部位转染样本数分别为11个和10个,阳性表达率为54.5%和60%。结论成功建立和优化了鸡胚培养和活体定时定位电转基因的方法。

鸡胚活体原位电转基因技术报告基因绿色荧光蛋白质量评估

目的在成功建立鸡胚活体原位电转基因技术的基础上,探讨报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达及其在鸡胚发育过程对胚胎形态结构影响,分析α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和神经丝蛋白(NF)的表达情况。方法活体原位电转基因技术将pCAGGS-GFP质粒转入带壳培养第3天和第3天去壳培养至第5天的鸡胚,在电转基因24h后荧光体视显微镜观察,选择对照组和阳性表达胚胎,每组各5个胚胎,冷冻切片后进行荧光免疫组织化学检测α-SMA和NF分别在脊髓和视顶部位的表达状况。结果在脊髓和视顶不同发育阶段和转染的不同时间,实验组、对照组及GFP阳性表达区域和正常区域内α-SMA、NF两种蛋白表达不存在差异,胚胎形态结构也不存在差异。结论原位电转GFP在鸡胚发育早期过程中不影响正常基因的表达及鸡胚胎发育形态结构的变化,可以作为报告基因。

一种自制电极鸡胚视顶盖转基因技术

目的建立一种高效鸡胚视顶盖电转基因技术,对自制电极进行评估。方法在鸡胚发育的第5天（E5）,将0.5 g/L的p CAGGS-绿色荧光蛋白（GFP）质粒0.25～0.5μl准确地注射到视顶盖内,每组60个鸡胚,在电压18V、每次脉冲60ms、间隔100ms、电脉冲6次的条件下,以原装电极为对照,自制电极为实验组进行定时定位活体电转基因,电转后在E6~E12时观察胚胎成活率,取材后在体视荧光显微镜下观察报告基因GFP表达结果以此判断转染的效率。结果在鸡胚模型中,通过自制电极转染鸡胚视顶盖,24h后鸡胚成活率达到89%,在鸡胚发育到E12时存活率达到35%,与原装电极相比分别提高48.3%和600%个百分点。结论自制电极在鸡胚视顶盖电转过程对胚胎的损伤小,转染后胚胎成活率高,为鸡胚视顶盖电转基因提供一种高效的转染技术。

基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞相关基因功能方法的建立

目的建立一种基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞（NSCs）相关基因功能的方法。方法 RT-PCR检测鸡胚发育不同时期脊髓NSCs表面标志物;在鸡胚胚龄（E）E2.5~E3时,利用活体电转基因技术将p CAGGSGFP质粒转染到鸡胚脊髓,E6时体视荧光显微镜下筛选绿色荧光蛋白（GFP）阳性胚胎,每组至少取材5个;通过脊髓横切及open-book技术观察神经纤维投射情况;普通光学显微镜下剥离出3~5条脊髓,经胰蛋白酶消化、离心后,无血清NSCs培养基重悬获得细胞铺板,于37℃、5%CO_2细胞培养箱内培养,定时观察GFP阳性脊髓NSCs的形态变化。结果 RT-PCR结果表明,鸡胚脊髓中阳性表达NSCs表面标志物;随后的脊髓横切及open-book结果表明,GFP阳性转染侧的神经纤维能穿过底板,投射到脊髓对侧;而脊髓NSCs体外培养结果显示,GFP标记的脊髓细胞具有典型的NSCs形态,继续培养后有明显突起产生。结论本实验成功建立了一种基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞相关基因功能的方法。

小鼠cofilin-1基因及其真核表达载体的构建与体内外表达

【目的】构建能够在神经系统中高效表达的小鼠cofilin-1野生型(Cfl1-wt)、活化型(Cfl1-S3A)、失活型(Cfl1-S3D)3种真核表达载体,并研究其在鸡胚脊髓神经元中的表达情况,为进一步探讨cofilin-1在大脑发育过程中对神经元迁移的影响奠定基础。【方法】从成年小鼠大脑组织中提取RNA,经反转录获得cDNA样本,RT-PCR扩增小鼠cofilin-1基因的CDS区,经引物设计引入点突变,扩增了野生型、活化型及失活型的cofilin-1基因片段,克隆入pCAG-MCS-myc真核表达载体中。经双酶切和测序鉴定后,转染CHO细胞,通过半定量RT-PCR和免疫荧光染色检测其在细胞中的表达情况。利用鸡胚活体原位电转的方法,将重组质粒转染胚胎发育第3天(E3)的鸡胚脊髓,在胚胎发育第6天(E6)取材,切片后经免疫荧光染色观察并统计分析重组质粒在脊髓中的表达情况。【结果】克隆并模拟了小鼠cofilin-1野生型、活化型和失活型的cDNA片段,成功构建了pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAGcfl1-S3D3种真核表达载体。体外转染CHO细胞,半定量RT-PCR检测及统计学分析表明,转染重组质粒的CHO细胞中,Cofilin-1mRNA相对表达量与对照组(未转染质粒的正常CHO细胞)存在显著性差异;免疫荧光染色后观察到了Cofilin-1融合蛋白的表达。对经活体原位电转转染重组质粒的鸡胚脊髓切片进行免疫荧光染色,检测到Cofilin-1融合蛋白的表达,且重组质粒转染效果与pCAG-EGFP转染效果无明显差异。【结论】pCAG-cfl1-wt、pCAGcfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D3种真核表达载体的成功构建及其在体内外的高效表达,为进一步研究cofilin-1及其Ser3位点的磷酸化在神经元迁移中的作用机制奠定了基础。

两种真核启动子体内外转录活性比较研究

启动子作为基因工程表达载体的核心组成部分,在很大程度上决定了目的基因的转录活性。为筛选出一个转录活性较高的真核启动子,以目的蛋白与增强型绿色荧光蛋白融合表达的形式,在体内外检测CMV和CAG两种真核启动子的转录活性。首先,通过常规分子生物学技术将神经钙黏着蛋白(N-cad)克隆到p CAG-MCS-EGFP质粒中(携带CAG启动子),菌落PCR、双酶切及测序验证;与p EGFP-N-cad质粒(携带CMV启动子)一起通过磷酸钙法分别转染HEK293T细胞,比较两种质粒在体外细胞水平转染目的基因效率;随后,通过已建立的鸡胚脊髓活体电转方法比较两种质粒在活体鸡胚脊髓内转录目的基因效率,冷冻切片后进行荧光强度观察;而体内外实验均应用常规Western blot和RT-PCR技术验证目的基因N-cad在蛋白及基因水平上的表达。荧光显微镜观察结果表明,CMV启动子仅能在体外细胞水平上行使其转录活性,而CAG启动子可在体内体外高效行使其转录活性,进一步的Western blot和RT-PCR结果与荧光观察结果一致。该研究结果可为体内研究目的基因功能时的载体构建提供借鉴。

鸡源Wnt3a融合蛋白表达载体的构建及其对鸡胚脊髓神经前体细胞增殖和轴突形成的影响

目的构建鸡源Wnt3a融合蛋白真核表达载体(pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP),并探讨其在鸡胚脊髓发育过程中超表达后对神经前体细胞增殖及轴突形成的影响。方法利用分子生物学手段,提取鸡胚脊髓总RNA并获得Wnt3a片段,将其克隆到pCAG-MCs-EGFP载体中构建pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP表达载体。在鸡胚发育至2.5~3d(E2.5~E3)时,利用鸡胚活体电转技术将pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP(实验组)和pCAG-MCs-EGFP(对照组)质粒分别转入鸡胚脊髓,E4时取材切片,每组5个胚胎组织,采用免疫荧光染色技术检测Wnt3a和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达变化分析Wnt3a与细胞增殖间的关系,根据载体自发绿色荧光蛋白(GFP)观察脊髓神经前体细胞轴突生成情况。结果 pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP表达载体基因测序结果与Gene bank中基因序列一致,将pCAGMCs-Wnt3a-EGFP导入鸡胚脊髓中发现绿色荧光。在脊髓组织切片水平上,免疫荧光染色结果表明,Wnt3a在鸡胚脊髓中能够超表达。Wnt3a超表达后,与对照组比较,含有轴突的神经元数量明显减少(n=3,P<0.01),而PCNA的表达量显著增加(n=3,P<0.01)。结论成功构建了鸡源性Wnt3a融合蛋白真核表达载体,并证实Wnt3a在鸡胚发育过程中促进神经前体细胞的增殖并抑制轴突的形成。

鸡胚发育过程敲减神经型钙黏蛋白表达对视顶盖神经元迁移及神经丝蛋白的影响

目的 阐明鸡胚发育过程神经型钙黏蛋白（N-cadherin）在中枢神经系统中的作用及其对神经丝蛋白（NF）表达的影响。 方法 鸡胚正常培养到第3天（E3），采用鸡胚带壳开窗培养方法，取出3～4ml蛋清，开窗培养至E5，将N-cadherin干扰载体pGPU6-GFP-neo-N-cadherin-shRNA通过活体电转基因技术导入视顶盖，电转后继续培养到E12，每组收集3个胚胎，取材，固定，包埋，切片后进行荧光免疫组织化学分析相关蛋白的表达。结果 鸡胚发育过程，敲减N-cadherin表达影响神经元迁移，被敲减的细胞主要停留在室管膜区，在N-cadherin受到抑制表达的区域，NF的表达也受到抑制，其表达明显减弱。 结论 N-cadherin的抑制表达可导致神经元的迁移发生紊乱，影响NF的表达。

鸡胚发育过程中音猬因子超表达对Pax家族基因表达的影响

目的 探讨鸡胚发育过程中,音猬因子（Shh）基因在脊髓中超表达后对配对框（Pax）基因家族Pax3、Pax6以及Pax7蛋白表达的影响。方法 在鸡胚龄2.5-3.0d（E2.5-E3）时,实验组利用鸡胚脊髓活体电转基因技术将携带Shh基因的质粒和携带有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的质粒共转入鸡胚脊髓,对照组则只转入报告基因质粒。E4时取材,每组至少取3例,冷冻切片后采用原位杂交技术检测Shh基因的mRNA表达水平,利用荧光免疫技术检测Shh在鸡胚脊髓中超表达后对Pax3,Pax6以及Pax7蛋白表达水平的影响,并将对照组及实验组中3种基因在脊髓两侧的表达量进行统计学分析。结果 原位杂交结果表明,E4时Shh的mRNA主要表达在脊髓底板和脊索,实验组结果显示,利用鸡胚脊髓活体电转技术成功建立了Shh超表达模型。对照组中荧光免疫结果表明,Pax3主要表达于脊髓翼板、生肌节、背根以及背根神经节;Pax6主要表达于跨越翼板和基板的脊髓中间部位;Pax7则主要均匀表达于翼板、顶板和生肌节。Shh超表达后,脊髓转染侧与未转染侧相比Pax3、Pax6以及Pax7的表达量差异极显著（P〈0.01）,这3种基因在脊髓中的表达均被抑制。结论 在鸡胚发育过程中,Pax家族Pax3、Pax6以及Pax7 3种基因在鸡胚脊髓中具有不同的表达模式,Shh超表达后对其均具有明显的抑制作用,显示这3种Pax基因受Shh信号通路调控。

一种鸡胚发育过程脊髓神经纤维投射研究方法的建立

目的建立一种鸡胚发育过程脊髓神经纤维投射的研究方法。方法采用鸡胚带壳开窗培养技术,在鸡胚胚龄3d(E3),通过活体电转基因技术将携带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒(pCAGGS-GFP)准确注射到脊髓腔进行定时定位活体电转,转染后3d在体视荧光显微镜下进行观察;取出GFP阳性表达的胚胎,剥离出脊髓,从顶板处破开之后将脊髓展开,用4%多聚甲醛固定1h后,对神经钙黏蛋白(N-cadherin)进行免疫荧光染色,用4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核;封片后在荧光显微镜下观察神经纤维投射情况。结果对比横向切片和脊髓展开标本,两者均观察到GFP阳性转染侧的神经元纤维穿过底板沿对侧脊髓白质区边缘投射到神经结节,在脊髓展开标本中还可观察到神经纤维穿过底板再纵向向脑部投射;而N-cadherin免疫荧光染色结果表明,GFP基因的转染对机体正常的发育无明显影响。结论本实验建立了一种鸡胚发育过程脊髓神经纤维投射的研究方法。

双色荧光示踪鸡胚脊髓两侧连合纤维投射研究方法的建立

目的建立1种双色荧光示踪鸡胚脊髓两侧连合纤维投射的实验方法。方法鸡胚孵育至胚龄2.5-3d,通过鸡胚活体原位电转基因技术将携带有报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的质粒（p CAGGS-GFP）准确注射到鸡胚脊髓腔,实现定时、定位活体电转基因。转染后继续孵育至6d,取GFP阳性表达的胚胎,部分做脊髓横向切片,部分利用open-book技术将脊髓展开观察连合纤维的发育情况,每组至少取3个标本。其后在脊髓非转染侧连合神经元所在之处,点状注射Di I乙醇溶液,封片后于4℃避光孵育3d,在荧光显微镜下观察脊髓连合纤维投射情况。结果脊髓横切及open-book结果显示,鸡胚脊髓GFP阳性转染侧的神经元轴突穿过底板投射到脊髓对侧;同时在open-book结果中还可观察到,转染侧轴突穿过底板后分别沿腹索和外侧索向头尾部投射;Di I标记的非转染侧连合神经元轴突也同样穿过底板投射到对侧,并在侧索白质内延伸。结论本实验成功建立了1种双色荧光示踪鸡胚脊髓两侧连合纤维投射的研究方法,为研究脊髓神经发育提供技术保障。

鸡胚发育过程中Shh超表达对脊髓神经纤维投射的抑制作用

目的探讨鸡胚发育过程中,sonic hedgehog（Shh）在脊髓中超表达后对神经纤维投射的影响。方法在鸡胚龄2.5～3d（E2.5～E3）时,利用鸡胚活体原位电转基因技术将Shh表达质粒和携带有报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的质粒共转入鸡胚脊髓,E6时取材切片,至少取3个材料,免疫荧光技术检验Shh的超表达,利用Open Book技术研究Shh在鸡胚脊髓中超表达后对神经纤维投射的影响。结果在脊髓组织切片水平上,免疫荧光结果表明,Shh在鸡胚脊髓中成功超表达,无论在组织切片上还是通过Open Book技术进行观察,与对照组相比,超表达后转染侧神经纤维都无法正常通过底板投射到对侧,表明Shh在鸡胚脊髓神经纤维投射方面具有重要作用。结论在鸡胚发育过程中,脊髓中Shh超表达后对神经纤维投射具有抑制作用。