重组人骨保护素与重组核因子κb活化因子受体蛋白对破骨前体细胞分化的影响

目的:对比重组人骨保护素(rhOPG-Fc)与重组核因子κb活化因子受体蛋白(rhRANK)对破骨前体细胞分化的影响。方法:采用成骨细胞与破骨前体细胞RAW264.7混合培养,在地塞米松、1,25(OH)2VitD3诱导下生成破骨细胞的方法。研究分3组:rhRANK组:10-5g/L;rhOPG-Fc组:10-5g/L;空白对照组。作用9d后观察破骨细胞数目和形态,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色阳性细胞个数,骨磨片吸收陷窝计数。结果:在空白对照组,小鼠成骨细胞与破骨前体细胞RAW264.7混合培养6d后,开始出现多核细胞,9d时可见大量成熟多核细胞,经TRAP染色证实为成熟破骨细胞,而rhRANK组及rhOPG-Fc组TRAP染色阳性多核细胞数较对照组均减少,特别是rhRANK组减少更明显。骨片吸收陷窝计数显示rhRANK组及rhOPG-Fc组较对照组也明显减少,而相对来说,rhRANK组较rhOPG-Fc组更少。结论:rhOPG-Fc与rhRANK均可以有效抑制破骨前体细胞分化成为成熟破骨细胞,且rhRANK较rhOPG-Fc抑制效果更明显。

重组核因子κB活化因子受体蛋白对破骨细胞活性的抑制作用

背景:核因子κB活化因子受体直接参与破骨细胞的活性及功能调节,在骨吸收类疾病发病中具有重要意义。通过基因工程得到的可溶性核因子κB活化因子受体蛋白可能为防治骨质疏松等骨吸收类疾病提供了新的有效手段。目的:观察重组重组核因子κB活化因子受体蛋白对体外培养破骨细胞活化、吸收活性的影响。方法:取新生24h内SD大鼠胎鼠的四肢长骨,机械分离获得破骨细胞,采用不同浓度重组重组核因子κB活化因子受体蛋白干预后,行抗酒石酸酸性磷酸酶染色及骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色,观察其对破骨细胞的生长情况。结果与结论:重组核因子κB活化因子受体蛋白对破骨细胞作用3d后,破骨细胞数量明显减少,以10-4mol/L重组核因子κB活化因子受体蛋白最为显著。核因子κB活化因子受体蛋白作用9d时,骨片吸收陷窝数明显减少。由此认为,在体外重组核因子κB活化因子受体蛋白可以有效抑制破骨细胞活化及骨吸收活性。

miR-144靶向NF-κB受体活化因子配体蛋白调控树突状细胞分泌细胞因子

目的探讨miRNA-144对树突状细胞(dendritic cells,DCs)成熟过程中细胞因子分泌的影响及机制。方法通过对本实验室前期工作中获得的DCs成熟过程中miRNA芯片结果进行数据挖掘,筛选得到DCs成熟过程中显著下调的miRNA(miR)-144,并使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激体外培养的DCs进行验证;检测miR-144转染DCs后相关细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23)的改变及信号通路(NF-κB、MAPK)活化情况;使用TargetScan预测miR-144的作用靶点并通过双荧光报告系统验证;进一步构建靶蛋白过表达DC2.4细胞系并检测miR-144拟似物转染该细胞系后细胞因子TNF-αmRNA的分泌情况。结果体外培养的DCs经LPS刺激成熟后miR-144的表达下调(P<0.01)。miR-144拟似物转染DCs后,TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23mRNA表达均出现下调(P<0.05,P<0.01),NF-κB磷酸化水平下降。通过信息学分析发现miR-144的潜在靶点为NF-κB受体活化因子配体蛋白基因(RANKL)并通过双荧光报告系统证明了该结论。在RANKL过表达DC2.4细胞系中转染miR-144拟似物后,TNF-αmRNA的表达不受影响。结论 miR-144靶向RANKL调控DCs细胞因子分泌。

基于RANKL/RANK/OPG信号通路探讨土贝母苷甲对糖尿病性骨质疏松大鼠骨质流失的影响

目的 探讨土贝母苷甲对糖尿病性骨质疏松(OP)大鼠骨质流失及核因子κB受体活化因子配体(RANKL)/核因子κB受体活化因子(RANK)/骨保护蛋白(OPG)信号通路的影响。方法 采用高脂高糖饮食+链脲佐菌素腹腔注射法构建大鼠糖尿病性OP模型,将60只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、土贝母苷甲低剂量组(1μmol/L)、土贝母苷甲高剂量组(5μmol/L)、OPG组(3 mg/kg)、土贝母苷甲高剂量+OPG组(5μmol/L土贝母苷甲+3 mg/kg OPG)。酶联免疫吸附(ELISA)法测定大鼠血清核心结合因子α1(CBF-α1)、Ⅰ型前胶原氨基端原肽(PINP)、骨钙素(OC)水平;Micro-CT测定骨密度(BMD)及骨小梁微结构参数;TRAP染色测定股骨表面破骨细胞数量(N.Oc/BS);HE染色观测大鼠骨组织病理变化;qRT-PCR法与Western blot法分别测定骨组织RANKL、RANK、OPG mRNA与蛋白水平。结果 与对照组相比,模型组大鼠血清CBF-α1、PINP、OC水平、股骨最大负荷、断裂挠度、BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、OPG mRNA与蛋白水平降低(P<0.05),Tb.Sp、N.Oc/BS、RANKL mRNA与蛋白、RANK mRNA与蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,土贝母苷甲高剂量组、OPG组血清CBF-α1、PINP、OC水平、股骨最大负荷、BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、OPG mRNA与蛋白水平升高(P<0.05),Tb.Sp、N.Oc/BS、RANKL mRNA与蛋白、RANK mRNA与蛋白表达降低(P<0.05);与土贝母苷甲高剂量组相比,土贝母苷甲高剂量+OPG组大鼠上述指标均进一步升高或降低(P<0.05)。结论 土贝母苷甲可能通过抑制RANKL/RANK/OPG通路,减少糖尿病性OP大鼠破骨细胞形成,抑制骨流失。