2型糖尿病患者骨保护素和NF-κB受体活化因子配体与左室舒张功能障碍的相关研究

【目的】探讨2型糖尿病(T2DM)患者血清骨保护素(OPG)和可溶性NF-κB受体活化因子配体(sRANKL)水平与可能左室舒张功能障碍(LADD)的相关性。【方法】本研究纳入68例T2DM患者和37例健康对照者,利用ELISA方法测定血清OPG和sRANKL水平,同时利用心脏彩超测定T2DM患者左室舒张功能,E/A<1定义为LADD。进一步将T2DM患者分为E/A≥1和E/A<1两个亚组。采用Spearman相关性分析、logistics回归分析和ROC曲线评估血清OPG和sRANKL与T2DM患者可能LADD的相关性。【结果】与健康对照者相比,T2DM患者血清OPG水平明显升高,差异有统计意义(P<0.01),而sRANKL水平降低,但无统计学意义(P=0.032)。亚组分析则显示E/A<1组的OPG水平较E/A≥1组升高(P<0.01),而sRANKL降低(P<0.01)。Spearman相关性分析显示,血清OPG水平与E/A比值呈负相关,而sRANKL则与E/A比值呈正相关。单因素logistics回归分析显示,血清OPG水平[OR(95%CI)=1.068(1.031,1.106),P<0.001]和sRANKL水平[OR(95%CI)=0.976(0.959,0.992),P=0.003]与T2DM患者可能LVDD显著相关。ROC曲线分析显示,联合OPG与sRANKL诊断糖尿病患者可能LADD的敏感性为78.13%,特异性为88.3%(曲线下面积:0.857;95%CI=(0.768,0.946);P<0.001)。【结论】T2DM患者血清中升高的OPG和降低的sRANKL水平提示其可能与LADD相关。

肾康注射液调节TGF-βⅠ型受体/Smad通路抑制肾纤维化的作用机制

目的肾康注射液(Shenkang injection,SKI)作为一种中药静脉注射剂,已在临床用于治疗慢性肾病。本研究探讨SKI调节TGF-βⅠ型受体/Smad通路抑制肾纤维化的作用机制。方法在37℃环境中,使用10 ng·mL^(-1)TGF-β1处理人小管上皮细胞(Human kidney proximal tubular cell,HK-2)48 h,建立体外肾纤维化模型。用SKI处理细胞48 h后,通过显微镜观察细胞的形态;采用Western blot、RT-PCR和免疫荧光技术检测α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅲ型胶原(Collagen typeⅢ,COI-Ⅲ)、TGF-β1、Smad3、Smad7和TβR-Ⅰ蛋白和基因的表达变化。结果SKI能抑制肾纤维化相关蛋白和基因的表达,如α-SMA和COI-Ⅲ。SKI调控与TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达,通过下调TGF-β1、Smad3和TβR-Ⅰ蛋白,上调Smad7蛋白表达,延缓肾脏纤维化。结论SKI抑制肾纤维化,可能通过下调TβR-Ⅰ、调控TGF-β/Smad通路相关分子的表达。

小鼠核因子κB受体活化因子配基(RANKL)活性区cDNA在毕赤酵母中分泌型表达

由小鼠骨组织提取总RNA ,采用RT PCR扩增得到小鼠核因子κB受体活化因子配基(RANKL)活性区域cDNA .将该cDNA片段克隆入表达载体pPIC9,重组载体转化巴斯德毕赤酵母GS115细胞 ,筛选Mut+表型 ,经甲醇诱导实现目的基因的分泌型表达 .Tricine SDS PAGE显示 ,表达产物约 2 6kD ,经Western印迹鉴定 ,表达产物可被RANKL抗体识别 .采用硫酸铵盐析、CM SephadexC 2 5层析纯化重组蛋白 .经测定 ,发酵液上清重组蛋白表达量约 11mg L .采用破骨细胞样细胞(osteoclastlikecell,OLC)诱导分化实验检测重组蛋白的生物活性 ,证实该重组蛋白可以促进OLC的生成 。

骨保护素、核因子κB受体活化因子配体与绝经后骨质疏松症中医证型变化的关系

目的:探讨骨保护素、核因子κB受体活化因子配体在绝经后骨质疏松症不同中医证型间变化的内在关系,为绝经后骨质疏松症的辨证分型提供理论和实验依据。方法:于2005-09/2006-09选择广州中医药大学附属骨伤科医院和广州军区总医院入院及门诊治疗的绝经后骨质疏松症患者108例。根据中医辨证分型的原则分为肾阳虚组、肝肾阴虚组、脾肾阳虚组、气滞血瘀组,组间在年龄分布、绝经年限及体质量指数有可比性(P>0.05)。采用双能X射线骨密度仪测量第2～4腰椎椎体侧位的骨密度。采用ELISA法测定患者雌激素、骨保护素、核因子κB受体活化因子配体的水平,应用方差分析方法分析绝经后骨质疏松症患者骨保护素、核因子κB受体活化因子配体、骨密度和雌激素在不同证型间的关系。结果:气滞血瘀组骨保护素和核因子κB受体活化因子配体水平高于肾阳虚组、脾肾阳虚组、肝肾阴虚组,差异均有显著性意义[分别为(504.71±353.14),(332.03±323.88),(448.22±304.16),(418.78±382.66)ng/L;(1348.22±489.87),(1245.62±510.53),(1258.31±575.71),(1233.14±594.32)ng/L,F=1196.31,287.54;137.42,216.56;280.39,342.72;P<0.01],雌激素水平及骨密度值明显低于肾阳虚组,差异有显著性意义[分别为(0.48±0.04),(0.68±0.08)g/cm2;(18.77±9.03),(22.14±8.16)ng/L,F=9.39,17.93,P<0.05]。脾肾阳虚组和肝肾阴虚组雌激素水平低于肾阳虚组,差异有显著性意义[分别为(19.44±8.67),(19.41±8.72),(22.14±8.16)ng/L,F=11.23,11.25,P<0.05],而血清骨保护素、核因子κB受体活化因子配体、骨密度组间比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:骨保护素/核因子κB受体活化因子配体/核因子κB受体活化因子平衡关系的破坏与绝经后骨质疏松症的发生发展有关,“肾阳虚损,瘀血阻滞”病机转变可能是绝经后骨质疏松症病理演变的一个重要环节。血清骨保护素、核因子κB受体活化因子配体水平有可能作为区别绝经后骨质疏松症气滞血瘀型与其他三型的客观检测指标。

2型糖尿病KKA^y模型小鼠肾脏中TGF-β及其受体和细胞外基质蛋白表达的关系

探讨 2型糖尿病动物模型KKAy 小鼠肾脏细胞外基质蓄积的原因和TGF β及其受体的关系。 15只KKAy 小鼠和 18只C5 7BL J小鼠 ,分成 3组 ,分别于 16、2 0和 2 4周处死动物 ,常规测体重、肾功能、血脂和尿蛋白 ,取肾皮质常规切片、染色 ,观察肾脏病理改变。用免疫组化和免疫印迹法检测不同周龄的KKAy 小鼠及参照组C5 7BL J小鼠肾皮质TGF β1及TGF βⅠ、Ⅱ型受体的表达 ,并用RT PCR方法检测肾皮质细胞外基质Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白(fibronectin ,FN)mRNA水平。KKAy 小鼠 16周龄以后便开始出现明显的肥胖、高血糖、高胰岛素血症和蛋白尿 ,符合2型糖尿病早期肾病特点。其FN和Ⅳ型胶原mRNA表达都比同龄参照组C5 7BL J小鼠高 2～ 4倍 ,其中以 16周时最为显著 ,FN为 1 5 3± 0 4 6比较 0 6 3± 0 16 (P <0 0 0 1) ;Ⅳ型胶原为 5 0 8± 1 92比较 1 2 1± 0 2 5 (P <0 0 1)。KKAy 小鼠肾小球内TGF β1及TGF βⅠ型受体的水平明显低于C5 7BL J小鼠 ,而Ⅱ型受体表达却高于C5 7BL J小鼠。2型糖尿病KKAy 小鼠早期肾病时 ,肾皮质细胞外基质合成增加 ,与TGF βⅡ型受体表达增加有关。

贲门腺癌中TGF-β1型受体启动子区甲基化状态分析

目的探讨贲门腺癌(gastric cardia adenocarcinoma,GCA)中TGF-β1型受体(transforminggrowth factor-beta receptor type 1 gene,TGFBR1)启动子区的甲基化状态及其与TGF-β1蛋白表达之间的相关性。方法分别应用甲基化特异性PCR(MSP)方法、RT-PCR方法和免疫组织化学法检测贲门腺癌组织及相应癌旁组织的TGFBR1甲基化情况、mRNA和蛋白表达情况,应用免疫组织化学法检测相应TGF-β1的蛋白表达情况。结果 TGFBR1在贲门腺癌组织的甲基化率为30.9%(34/110),显著高于癌旁正常组织(P<0.01)。Ⅲ期和Ⅳ期贲门癌患者中TGFBR1基因发生甲基化的比率显著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.05)。贲门癌组织中TGFBR1基因的mRNA及蛋白表达显著低于癌旁正常组织(P<0.05)且与其甲基化状态之间有明显的相关性。TGF-β1在贲门癌组织中的表达(65.5%)明显升高,与相应癌旁正常组织相比差异有统计学意义(P<0.01),且随肿瘤分期的增高和肿瘤分化程度的降低,TGF-β1的阳性表达率明显升高(P<0.05)。TGFBR1和TGF-β1蛋白在贲门腺癌中的表达呈明显的负相关。结论 TGF-β1型受体基因启动子区的高甲基化及其TGF-β1的过表达可能参与了贲门腺癌的发生发展过程,TGF-β1型受体基因启动子区发生甲基化导致的基因沉默可能是贲门腺癌发生的机制之一。

体外培养正常人黑素细胞TGF-β1及其I型受体的表达

目的:检测TGF-β1和TGF-βI型受体在体外培养正常人黑素细胞中的表达。方法:采用黑素细胞培养技术及免疫组化技术。结果:在体外培养正常人黑素细胞中有TGF-β1和TGF-βI型受体的表达。结论:黑素细胞中有TGF-β1和TGF-βI型受体的表达,结合其他实验,提示TGF-β1及其I型受体可能在白癜风的发病中发挥作用。

高糖激活p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路诱导CD8^+T淋巴细胞表达辅助性T淋巴细胞1型趋化因子受体3

目的探讨高糖对CD8+T淋巴细胞中辅助性T淋巴细胞(Th)1型趋化因子受体3(CXCR3)表达水平的影响及其可能的机制。方法体外不同浓度葡萄糖(5、10、25、50mmol/L)培养CD8+T淋巴细胞,检测其CXCR3mRNA及蛋白的表达水平变化。同时检测高糖环境下(50mmol/L葡萄糖)CD8+T淋巴细胞氧化应激信号通路相关蛋白P65、P38、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)蛋白表达及磷酸化水平,并观察使用相应抑制剂阻断各氧化应激信号通路对CXCR3mRNA及蛋白表达的影响。结果随着培养基中葡萄糖浓度的升高,5、10、25、50mmol/L葡萄糖处理的CD8+T淋巴细胞中CXCR3mRNA及蛋白表达水平逐渐升高,两两比较,差异均有统计学意义(P值均<0.05),该作用呈浓度依赖性增强。高糖组(50mmol/L葡萄糖)磷酸化的P65、P38、ERK、JNK表达水平均显著高于与正常组(5mmol/L葡萄糖,P值均<0.05)。加入P38信号通路抑制剂SB203580后,高糖环境下CD8+T淋巴细胞的CXCR3mRNA及蛋白的表达水平显著低于高糖组(P值均<0.05),至正常组水平(P值均>0.05);而加入P65信号通路抑制剂BAY11-7082、ERK信号通路抑制剂PD98059、JNK信号通路抑制剂SP600125后,高糖环境下CD8+T淋巴细胞的CXCR3mRNA及蛋白的表达水平仍显著高于正常组(P值均<0.05),与高糖组的差异无统计学意义(P值均>0.05)。结论高糖可能通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路诱导CD8+T淋巴细胞表达CXCR3,参与糖尿病周围神经病变发病中CD8+T淋巴细胞的趋化过程。

TGF-β_1及其Ⅱ型受体在原发性肝癌中表达的研究

目的 探讨原发性肝癌中转化生长因子β1 (TGF β1 )与其Ⅱ型受体的表达及其价值。方法 采用免疫组化技术对50例原发性肝癌、50例癌旁组织、20 例正常肝组织TGF β1 及其Ⅱ型受体表达进行检测,结合临床资料进行分析。结果 TGF β1 在癌旁组织的表达要高于癌组织,TGF β1RⅡ在肝癌组织的表达明显低于正常组织;TGF β1 在有转移的肝癌组织中的表达明显增高(P<0.01),而TGF β1RⅡ的表达在分化高、肿瘤小、转移少、复发间隔时间长的肝癌组织均较高(P<0.05)。结论 TGF β1 在原发性肝癌中表达异常增高,其高表达有利于肿瘤细胞的浸润转移;TGF β1RⅡ在肝癌组织表达降低,导致肝癌细胞负性调控障碍,这可能是肝细胞癌变的重要因素之一;TGF β1RⅡ的表达与肝癌的恶性进展成负相关,有潜在的治疗肝癌意义。

大鼠血管球囊损伤促进血小板活化、凝血酶受体及血管紧张素Ⅱ1型受体的mRNA表达

目的该研究通过建立大鼠主动脉内皮球囊损伤模型,观察血小板活化、凝血酶受体及血管紧张素Ⅱ1型受体的变化。方法将大鼠随机分为对照组(n=24)和手术组(n=24),并于术后3、7、14和28d取主动脉,通过组织学检查、放射免疫法和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测血管球囊损伤后内膜增生的过程、血小板表面GMP-140的数目、血管AT1受体和凝血酶受体mRNA表达的变化。结果①凝血酶受体mRNA在正常血管组织表达极弱,球囊损伤术后3d已显著增加,术后14d达峰值,术后28d开始下降。②AT1受体mRNA于术后3d明显增高,并持续至术后14d,术后28d恢复至对照水平。③GMP-140于术后3d明显升高,术后7d开始下降。④内皮损伤术后3d已有增殖的血管平滑肌细胞(VSMC)移行至内膜层,术后7d内膜开始增生,术后14dVSMC的增殖及内膜增生更为明显,术后28dVSMC的增殖明显减弱,细胞外基质增加,内膜继续增生。结论血小板活化、凝血酶受体和AT1受体mRNA表达增加参与了血管内皮损伤后内膜增生的过程。

截短型TGF-β Ⅱ型受体原核表达载体的构建

目的:构建截短型TGF-β型受体,为TGF-βⅡ型受体的研究提供平台。方法:用定向克隆方法将tTGF-β基因插入载体PET-28a,原核表达,构建重组质粒tTGF-βRⅡB。结果:经酶切鉴定及DNA序列测定,重组质粒tTGF-βRⅡB序列及阅读框架正确。结论:成功地构建了PET-28a-tTGF-βRⅡB重组质粒。

可溶性TGF-β_1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建表达人TGF—β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础. 方法:以RT—PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM—T—Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA 技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度. 结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系. 结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN, 可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.

培哚普利和缬沙坦对肝纤维化大鼠TGF-β_1及其Ⅱ型受体mRNA与Smad3、Smad7表达的影响

目的 观察培哚普利和缬沙坦抗大鼠肝纤维化的疗效。方法 6 0只Wistar大鼠随机平均分为 4组 :正常组、模型组、培哚普利治疗组和缬沙坦治疗组。四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型 ,治疗组于造模第 4周开始分别予以培哚普利和缬沙坦灌胃。RT PCR检测肝组织转化生长因子 β1(TGF β1)、Ⅱ型受体 (TGFRⅡmRNA) ;免疫组化技术检测TGF β1、Smad3及Smad7在肝内的表达及定位 ,肝组织HE染色检测病理改变。结果 与模型组大鼠比较 ,经培哚普利或缬沙坦治疗大鼠肝内TGF β1与TGFRⅡmRNA、以及Smad3蛋白表达明显降低 ;而Smad7的表达增加。TGF β1与Smad3的免疫阳性反应信号主要位于纤维间隔中的细胞浆 ,Smad7则主要在肝细胞浆表达 ,上述物质在两种药物组之间表达差异无显著性 (P >0 0 5 )。培哚普利或缬沙坦治疗后肝小叶均趋于正常 ,纤维间隔明显变薄。结论 培哚普利或缬沙坦均能有效地减轻肝纤维化大鼠的肝脏损伤及纤维化程度 ,其机理可能与直接或间接抑制肝内TGF β1、与TGFRⅡmRNA及Smad3表达 ,并促进Smad7表达有关。

TGF-β受体Ⅲ型与泌尿系肿瘤的研究进展

在肿瘤的分子致病机制研究中，TGF-β信号通路（trans—forming growth factor－β pathway）是受到全世界科研工作者广泛关注的通路之一。在该通路中活化的TGF-β配体通过与细胞表面特异性受体Ⅰ型（TβR1）、Ⅱ（TβR2）和Ⅲ型（TβR3）结合而发挥细胞生物学效应，该作用与人类肿瘤的发生、发展关系密切。

肾上腺素受体激动剂对新生大鼠心肌细胞胞质型磷脂酶A_2的活化作用

目的探讨肾上腺素受体(adrenergic receptor,AR)激动剂对培养的新生大鼠心肌细胞胞质型磷脂酶A2(cy-tosolic phospholipase A2,cPLA2)的磷酸化效应及机制。方法分别用β-AR激动剂异丙肾上腺素(10μmol/L)和α1-AR激动剂苯肾上腺素(10μmol/L)处理培养的新生大鼠心肌细胞,Western blot法检测cPLA2及丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)磷酸化水平随时间变化的效应曲线。结果α1-AR激活引起心肌细胞内cPLA2磷酸化水平显著增高,此效应可能由p38MAPK及ERK1/2的磷酸化介导;β-AR激活可引起p38MAPK及ERK1/2的磷酸化,但不伴有cPLA2的磷酸化。结论实验结果揭示了心肌细胞中α1-AR激动在调控cPLA2活性方面的重要作用。

TGF-β Ⅲ型受体介导的信号通路及其在纤维化疾病中的作用

转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在细胞的自我调控包括细胞增殖、分化、凋亡、胚胎发育、免疫监督、血管再生等过程中发挥重要作用。TGF-βⅢ型受体(TβRⅢ)是TGF-β超家族的辅助受体之一,TβRⅢ不仅能介导TGF-β超家族配体依赖的Smad经典通路,还可以介导非Smad依赖的信号通路,参与调控细胞的多种信号通路,在纤维化、肿瘤、心血管系统等疾病中发挥重要作用。该文就TβRⅢ参与的信号通路及其在纤维化疾病中的作用作一综述。

缬沙坦对肝纤维化大鼠TGF-β1及其Ⅱ型受体mRNA与Smad3、Smad7表达的影响

目的 观察缬沙坦抗大鼠肝纤维化的疗效及作用机制。方法 将 80只Wistar大鼠随机分为 5组 ,每组 16只大鼠 ,A组为正常对照组 ,B、D组为肝纤维化模型组 ,C、E组为缬沙坦治疗组。B、C、D和E组大鼠均给四氯化碳 8W诱导肝纤维化 ,C、E组大鼠分别于第 1、4W予以缬沙坦灌胃治疗。A、B、C组大鼠于第 8W处死 ,D、E组大鼠于第 12W处死。结果 与模型组比较 ,治疗组肝内TGFβ1与TGFRⅡmRNA以及Smad3表达明显降低 ,而Smad7的表达增加 ,Smad3的免疫阳性反应信号主要位于纤维间隔中的细胞浆 ,Smad7则主要在肝细胞浆表达。大鼠肝组织TGFβ1与TGFRⅡmRNA、Smad3与Smad7在C组与E组表达比较差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,而B组与D组TGFβ1与TGFRⅡmRNA、Smad3与Smad7比较差异无显著性。结论 缬沙坦减轻肝脏损伤及纤维化程度的机制与抑制肝内TGFβ1与TGFRⅡmRNA及Smad3表达 ,促进Smad7表达有关。

TGF-βⅡ型受体mRNA及蛋白在人IgA肾病肾小管上皮的表达

为探讨转化生长因子 -β (TGF-β)在人 Ig A肾病肾小管间质纤维化中的作用 ,本文用原位杂交及免疫组织化学方法研究转化生长因子 -β 型受体 (TGF-βR ) m RNA和蛋白在肾小管上皮细胞的表达。结果表明 :TGF-βR m RNA定位于肾小管及集合管上皮细胞。 TGF- βR 蛋白定位于肾小管及集合管上皮细胞的基底面、腔面及侧面 ,或呈与基底膜相垂直的基底部纵纹出现于一些细胞的胞质内。肾小球系膜细胞也可见 TGF- βR m RNA及蛋白表达 ,但不如肾小管明显。以上结果提示肾小管和集合管上皮细胞的受体可与 TGF- β特异性结合。 TGF- β则通过自分泌作用促进小管上皮细胞合成与分泌ECM。过多的 ECM在小管周围沉积 ;或 TGF-β抑制 ECM的降解 ,终将导致 Ig