沙库巴曲缬沙坦对自发性高血压大鼠心肌钙调神经磷酸酶/活化T细胞核因子3信号通路的影响

目的 探讨沙库巴曲缬沙坦对自发性高血压大鼠(SHR)心肌钙调神经磷酸酶/活化T细胞核因子3(CaN/NFAT3)信号通路的影响。方法 选择16只16周龄雄性SHR完全随机分为模型组(8只)和治疗组(8只),选择相同周龄的8只血压正常的Wistar-Kyoto大鼠作为对照组。治疗组大鼠给予沙库巴曲缬沙坦65 mg/kg,对照组和模型组大鼠给予等容积0.9%氯化钠溶液,均每天1次灌胃,连续4周。干预4周后,超声心动图检测各组大鼠心脏舒张期室间隔厚度(IVSd)和左心室舒张期后壁厚度(LVPWd);组织病理学评估心肌细胞形态及心肌纤维化程度;免疫组织化学染色和蛋白质印迹法检测心肌组织CaN和NFAT3蛋白表达情况。结果 干预后,模型组大鼠IVSd、LVPWd均高于对照组[(2.53±0.35)mm比(1.28±0.14)mm、(2.32±0.29)mm比(1.31±0.12)mm],而治疗组大鼠IVSd、LVPWd[(2.02±0.15)mm、(1.85±0.14)mm]均低于模型组(均P<0.01)。模型组心肌细胞横截面积和心肌胶原纤维百分比均明显高于对照组,而治疗组心肌细胞横截面积和心肌胶原纤维百分比均低于模型组(均P<0.01)。免疫组织化学染色结果显示,模型组心肌组织CaN蛋白表达水平高于对照组,治疗组CaN蛋白表达水平低于模型组(均P<0.01)。蛋白质印迹法检测结果显示,模型组CaN蛋白和NFAT3蛋白表达水平均高于对照组[(0.95±0.05)比(0.55±0.05)、(0.84±0.04)比(0.53±0.05)],而治疗组CaN蛋白和NFAT3蛋白表达水平[(0.65±0.05)、(0.65±0.03)]均低于模型组(均P<0.01)。结论 沙库巴曲缬沙坦能够减轻SHR心肌纤维化及抑制心肌肥厚,其作用机制可能与抑制CaN/NFAT3信号通路有关。

基于钙调磷酸酶-活化T细胞核因子3信号转导通路探究四逆汤治疗心力衰竭的分子机制

目的:分析钙调磷酸酶-活化T细胞核因子3(CaN-NFAT3)信号转导通路在四逆汤治疗心衰过程中的分子机制。方法:取SPF级SD大鼠60只,分10只作为空白对照组外,余50只采用连续ip盐酸阿霉素(0.002 5 g.kg-1,每周1次,连续6周)方法复制大鼠心力衰竭模型,待造模成功后将动物分为模型对照组与四逆汤高、中、低剂量(5.6,2.8,1.4 g.kg-1)治疗组,用四逆汤水煎液治疗8 d后,分别检测CaN的活性、心肌钙含量、去磷酸化NFATc蛋白的相对表达。结果:四逆汤水煎液高、中剂量治疗组CaN活性均明显低于模型组(P<0.01)、钙含量明显升高(P<0.01)、大鼠心肌组织中去磷酸化NFATc/β-actin吸光度比值较模型对照组显著降低(P<0.01)。结论:CaN-NFAT3信号转导通路的抑制为四逆汤治疗心力衰竭的关键分子机制。

参附汤对心阳虚型慢性心力衰竭钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子3信号转导通路的影响

目的:观察参附汤对心阳虚型慢性心力衰竭大鼠的影响。方法:大鼠随机分为4组,正常组,模型组,地高辛组,参附汤组(按生药量计为5 g·kg-1,ig),除正常组外,均采用大鼠ip阿霉素4 mg·kg-1的方法建立心阳虚型慢性心力衰竭模型,每周1次,共6周。在造模的同时给药组每天ig给药1次,持续7周,末次给药后测心功能,取标本检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)含量,心肌钙调神经磷酸酶(CaN)含量、钙含量、活化T细胞核因子3(NFAT3)蛋白的相对表达。结果:与正常组比较,模型组心功能降低,体重降低,心脏指数升高,SOD活性降低,MDA含量升高,心肌CaN含量、钙含量、大鼠心肌组织中NFAT3/β-actin吸光度比值显著升高(P<0.01);与模型组比较,参附汤组心功能升高,体重增加,心脏指数降低,SOD活性升高,MDA含量降低,CaN含量、钙含量、大鼠心肌组织中NFAT3/β-actin吸光度比值降低(P<0.05);参附汤组对受损伤的心肌组织和心阳虚症状有一定的改善作用。结论:参附汤通过抑制CaN-NFAT3信号转导通路治疗心阳虚型慢性心力衰竭。

芪白平肺胶囊可降低慢性阻塞性肺疾病钙调磷酸酶和活化T细胞核因子c3(NFATc3)的水平

目的通过建立慢性阻塞性肺疾病(COPD)痰瘀阻肺证大鼠模型,观察益气化痰祛瘀方-芪白平肺胶囊(QPC)对钙调磷酸酶(Ca N)-活化T细胞核因子c3(NFATc3)信号分子表达的影响,探讨QPC对COPD肺血管重构的干预机制。方法雄性SD大鼠60只,随机分为正常组、模型组、高、中、低剂量QPC组和硝苯地平组。采用游泳、烟熏、低氧,建立COPD痰瘀阻肺证大鼠模型;观察QPC对肺功能参数和大鼠的肺血管形态学的影响;通过实时荧光定量PCR检测大鼠肺组织Ca N和NFATc3mRNA的表达、Western blot法检测Ca N和NFATc3的蛋白表达。结果模型组大鼠第0.3秒用力呼气容量(FEV0.3),用力肺活量(FVC)和FEV0.3/FVC等肺功能参数值显著下降,高、中、低剂量QPC组和硝苯地平组的肺功能参数值均有不同程度的上升。模型组大鼠肺血管的管壁增厚,代偿性肺气肿形成。高、中、低剂量QPC组和硝苯地平组也存在血管壁增厚、肺泡扩张,但程度较轻。与正常组相比,模型组肺组织Ca N和NFATc3的mRNA和蛋白表达水平显著增加;与模型组相比,高、中、低剂量QPC以及硝苯地平组的Ca N和NFATc3的mRNA和蛋白表达量显著减低。结论 QPC可降低COPD肺组织Ca N、NFATc3的水平。

NFAT3在充血性心力衰竭气虚血瘀证患者舌苔液中的表达及意义

目的研究活化T细胞核因子3(nuclear factor of activated T-cells 3,NFAT3)在充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF)气虚血瘀证患者舌苔液中的表达及与临床指标相关性,初步拟定该证候的诊断界值。方法收集CHF气虚血瘀证患者及健康对照者各30例,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测舌苔液中NFAT3的含量。结果NFAT3在CHF气虚血瘀证患者舌苔液的含量为(481.40±103.00)pg/mL,明显高于健康对照者舌苔液的含量[(237.90±156.50)pg/mL](P<0.01);且随着美国纽约心脏协会(New York Heart Association,NYHA)心功能分级的增加,CHF气虚血瘀证患者舌苔液中NFAT3含量不断升高(P<0.01);CHF气虚血瘀证患者舌苔液NFAT3与NYHA心功能分级呈正相关性(r=0.927,P<0.01),与B型脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)(r=0.806,P<0.01)呈正相关性,与左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)呈负相关性(r=-0.739,P<0.01)。绘制受试者操作特性曲线(receive operating characteristic,ROC)初步拟定舌苔液清中NFAT3诊断CHF气滞血瘀证的界值为363.37 pg/mL,曲线下面积为0.91。结论NFAT3能够反映CHF病情轻重程度,可为CHF气虚血瘀证提供客观化、量化的参考和依据。

NFATc3敲除对肝癌细胞转录组的影响及其潜在靶基因的初步筛选

目的探究NFATc3基因敲除对肝癌细胞转录组的影响,并对NFATc3调控的靶基因进行初步筛选,以期为明确NFATc3靶基因及寻找新的抗肝癌治疗靶点提供依据。方法利用敲除NFATc3的SMMC7721细胞,在有或无仙台病毒(Sendai virus,SeV)感染时进行转录组测序(RNA sequencing,RNA-Seq)检测,并对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。对两组测序数据差异基因交集中的免疫相关基因进行PPI蛋白网络互作分析,并利用qRT-PCR实验验证敲减或过表达NFATc3对肝癌细胞内S100A8和S100A9表达水平的影响。利用数据库数据,分析肝癌中S100A8和S100A9 mRNA表达水平及预后。结果经RNA-seq分析发现,肝癌细胞中NFATc3敲除后差异表达基因主要富集在发育、代谢、细胞外基质和血管生成等通路。PPI蛋白网络分析发现S100A8和S100A9可能是NFATc3的重要靶基因。qRT-PCR实验结果显示敲除或敲减NFATc3均可上调S100A8和S100A9的表达,而表达外源NFATc3则可下调S100A8/S100A9的表达。数据库分析显示,肝癌组织中S100A8/S100A9的表达水平显著高于癌旁组织,S100A8/S100A9高表达的肝癌患者与患者生存期短及预后较差相关。结论肝癌细胞中NFATc3基因敲除影响的宿主基因功能主要富集在发育、代谢、细胞外基质和血管生成等通路。NFATc3可以抑制S100A8和S100A9基因的转录表达,S100A8和S100A9可能是肝癌中NFATc3调控的潜在靶基因。

高糖激活Ca^(2+)-CaN-NFAT3信号通路致H9c2细胞肥大

目的:利用细胞实验探讨不同高糖浓度培养H9c2细胞是否引起心肌细胞肥大,探讨Ca2+-Ca NNFAT3信号通路是否参与高糖引起H9c2心肌细胞肥厚过程。方法:体外培养H9c2大鼠心肌细胞48 h,分为5mmol/L糖对照组、25mmol/L糖培养组、50 mmol/L糖培养组、25mmol/L糖培养加L型钙通道阻滞剂苯磺酸氨氯地平[商品名络活喜(Norvasc)]组和50 mmol/L糖培养加Norvasc组5组。观察H9c2细胞形态并测量细胞表面积大小;荧光分光光度法检测心肌细胞内钙离子浓度[Ca2+]i;ELISA测细胞内Ca N浓度;real-time PCR法及Western blot检测Ca NAβ、NFAT3和β-MHC的mRNA及蛋白表达。结果:细胞大小、单细胞平均[Ca2+]i测定荧光值及细胞内Ca N浓度在随糖浓度升高呈阶梯上升,50 mmol/L时达到最高点。加入Norvasc后细胞大小较相同条件不加Norvasc者降低。Ca NAβ、NFAT3和β-MHC的mRNA及蛋白表达随糖浓度升高逐步升高,50 mmol/L时达最高。加入Norvasc后Ca NAβ、NFAT3和β-MHC的mRNA及蛋白表达均较未加Narvasc组明显降低。结论:高糖通过激活Ca2+-Ca N-NFAT3信号通路引起H9c2心肌细胞肥大。

激活TGR5通过CaN/NFAT3途径减轻高糖诱导的心肌细胞肥大

目的:观察激活G蛋白偶联胆汁酸受体1(GPBAR1,又称TGR5)对高糖诱导的小鼠心肌肥大的影响,并探讨钙调神经磷酸酶(CaN)/活化T细胞核因子3(NFAT3)信号途径在其中的作用。方法:原代培养小鼠心肌细胞,采用图像分析系统测定细胞表面积,BCA法测定细胞蛋白含量,通过RT-PCR及Western blot方法检测TGR5、CaN及NFAT3的mRNA及蛋白表达变化。结果:成功培养小鼠心肌细胞。高糖明显诱导心肌细胞表面积及细胞蛋白含量的增加(P<0.05)同时CaN及NFAT3的表达也增加(P<0.05)。激活TGR5或给予CaN抑制剂环孢素A均能抑制高糖引起的心肌细胞肥大及NFAT3表达增加(P<0.05)。给予TGR5干扰慢病毒可阻断TGR5对心肌细胞肥大的上述改善作用(P<0.05)。结论:激活TGR5能减轻高糖诱导的心肌细胞肥大,其机制可能与抑制CaN/NFAT3信号通路有关。

激活TGR5通过抑制CaN/NAFT3减轻ET-1诱导的心肌细胞肥大

目的观察G蛋白偶联胆汁酸受体1(G protein-coupled bile acid receptor 1,TGR5)受体激活后对内皮素-1(endothelin-1,ET-1)诱导心肌细胞肥大的作用及其机制的探讨。方法原代培养乳鼠心肌细胞,分为空白对照组和ET-1组,ET-1组的浓度分别为10^(-6)、10^(-7)、10^(-8) mmol/L,分别培养12、24、36、48 h,分别检测各组心肌细胞表面积和总蛋白浓度,建立心肌肥大细胞模型。将心肌细胞分为对照组、ET-1组、ET-1+INT-777(TGR5受体激动剂)组、ET-1+INT-777+TGR5 siRNA(干扰TGR5表达)组、ET-1+INT-777+TGR5 siRNA-NC(空病毒)组。采用图像分析系统测定心肌细胞表面积,BCA法测定细胞总蛋白量,RT-PCR检测TGR5、钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)的mRNA,Western blot方法检测心房尿钠因子(atrial natriuretic factor,ANF)、β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-MHC)、TGR5、CaN、活化T细胞核因子3(activated T cell nuclear factor 3,NFAT3)的蛋白表达变化。结果 48 h内,ET-1诱导心肌细胞肥大在10^(-8) mmol/L～10^(-6) mmol/L浓度范围内成明显浓度依赖性和时间依赖性(P<0.05),其中ET-1 10^(-6) mmol/L培养48 h心肌细胞表面积为(3 624.7±71.60)um^2,总蛋白量(51.810±1.47)μg,显著高于对照组表面积(1 560.8±3 188.94)um^2和总蛋白(37.827±0.47)μg(P<0.05)。与对照组相比,ET-1组心肌细胞表面积、总蛋白、ANF及β-MHC表达增加(P<0.05),CaN及NFAT3的表达增加(P<0.05)。与ET-1组心肌细胞表面积(4 167.59±271.11)um^2、总蛋白(57.765±0.553)μg、ANF/GAPDH(0.587±0.012)、β-MHC/GAPDH(0.422±0.016)、CaN/GAPDH(0.529±0.006)及NFAT3/Histone3(0.811±0.014)相比,给予TGR5受体激动剂组心肌细胞表面积(2 421.69±123.61)um^2、总蛋白(42.714±0.542)μg、ANF/GAPDH(0.229±0.011)、β-MHC/GAPDH(0.230±0.018)、CaN/GAPDH(0.247±0.008)及NFAT3/Histone3(0.407±0.008)的表达表达增加受到抑制(P<0.05)。予以siTGR5转染细胞后,部分消除了上述的抑制作用(P<0.05)。结论激活TGR5可改善ET-1诱导心肌细胞肥大,其机制可能部分与抑制CaN/NFAT3信号通路有关。

银丹心脑通软胶囊通过抑制CaN/NFATc3信号通路改善球囊损伤所致大鼠颈动脉血管内膜增生

目的探究银丹心脑通软胶囊(Yindan Xinnaotong capsule,YDXNT)是否通过调控钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)/活化T细胞核因子c3(Nuclear factors of activated T cell c3,NFATc3)信号通路改善球囊损伤所致大鼠颈动脉血管内膜增生。方法将雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(Model)和YDXNT给药组(YDXNT),采用球囊导管术建立大鼠左侧颈动脉内膜增生模型。造模次日至第14日,YDXNT给药组灌胃1.0 g/kg YDXNT混悬液,Sham和Model组灌胃等体积双蒸水。造模2周后麻醉后取左侧颈动脉标本,HE染色观察颈动脉血管病理学形态;免疫荧光技术检测颈动脉血管新生内膜中CaN、NFATc3、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、单核趋化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)蛋白表达情况。结果与Sham组相比,Model组颈动脉血管内膜厚度明显增加,管腔狭窄,新生内膜面积(Neointimal area,NIA)、NIA/中膜面积(Media area,MA)、NIA/内弹力板围绕面积(Internal elastic lamina area,IELA)明显升高;IL-1β、TNF-α、MCP-1、CaN蛋白表达明显增多(P<0.05),NFATc3蛋白核转位明显增多(P<0.05);与Model组相比,YDXNT组颈动脉血管内膜厚度明显降低,管腔增大,NIA、NIA/MA、NIA/IELA明显降低;IL-1β、TNF-α、MCP-1、CaN蛋白表达明显降低(P<0.05),NFATc3蛋白核转位明显减少(P<0.05)。结论YDXNT至少可能通过抑制CaN/NFATc3信号通路,减轻炎症反应,改善球囊损伤所致大鼠颈动脉血管内膜增生。

上皮性卵巢癌组织NFAT3、Maspin表达及临床意义

目的探讨上皮性卵巢癌组织活化T细胞核因子3(NFAT3)、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(Maspin)表达及临床意义。方法选取2017年1月至2019年4月我院保存的上皮性卵巢癌组织97例,同时选取良性卵巢肿瘤56例,正常卵巢组织50例作为对照组,采用免疫组化染色法检测NFAT3、Maspin表达。结果上皮性卵巢癌NFAT3、Maspin蛋白阳性表达率分别为51.55%和67.01%,明显高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织(P<0.05);临床分期Ⅲ~Ⅳ期、中低分化和有淋巴结转移患者NFAT3蛋白阳性表达率分别为72.00%、59.21%和70.91%,明显高于Ⅰ~Ⅱ期、高分化和无淋巴结转移患者(P<0.05);临床分期Ⅲ~Ⅳ期和有淋巴结转移患者Maspin蛋白阳性表达率分别为44.00%和47.27%,明显低于Ⅰ~Ⅱ期和无淋巴结转移患者(P<0.05);上皮性卵巢癌组织NFAT3和Maspin蛋白呈负相关(rs=-0.373,P<0.05)。结论上皮性卵巢癌组织NFAT3、Maspin表达上调,与临床分期、分化程度及淋巴结转移有关,两者间存在负相关系。

体外高糖环境对H9C2心肌细胞增殖的影响及其机制探讨

目的观察体外高糖环境对H9C2心肌细胞增殖的影响,并探讨其作用机制。方法将体外培养鼠胚心肌细胞H9C2随机分为四组,1组培养液中加入终浓度为5.5 mmol/L的D-葡萄糖,2组加入终浓度为27.5 mmol/L的甘露醇和5.5 mmol/L的D-葡萄糖,3组加入终浓度为33 mmol/L的D-葡萄糖,4组加入终浓度为2μmol/L的经典瞬时受体蛋白(TRPC)阻滞剂SKF96365和终浓度为33 mmol/L的D-葡萄糖。分别在培养24、48、72 h时,采用CCK8法测定细胞增殖率,实时定量PCR法测定经典瞬时受体蛋白6(TRPC6)、活化T细胞核因子3(NFAT3)mRNA;72 h时采用Western blotting法检测TRPC6及NFAT3蛋白。结果培养72 h时1、2、3、4组细胞增殖率分别为105.88%±10.01%、98.67%±8.97%、28.55%±6.32%、49.18%±7.14%,3组较1、2组降低(P均<0.05),4组较3组增高(P<0.05);3组TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相对表达量较1、2组增加(P均<0.05),4组较3组下降(P均<0.05)。结论高糖抑制心肌细胞增殖;促进心肌细胞TRPC6表达,导致TRPC通道开放,启动钙调神经素(Ca N)/活化T细胞核因子(NFAT)通路,可能是其作用机制。

线粒体乙醛脱氢酶2通过下调拮抗高糖引起的乳鼠心肌细胞损伤

目的探讨钙调神经磷酸酶(CaN)-活化的T细胞核因子(NFAT)3通路是否介导乙醛脱氢酶(ALDH)2对高糖处理的乳鼠心室肌细胞的作用。方法无菌条件下取出生3 d内SD大鼠乳鼠心脏,心尖部剪碎并用胰蛋白酶和胶原酶2混合酶消化成单个细胞,经差速贴壁后并在培养液中加入5-Brdu进行培养,当其生长呈融合状态时对心室肌细胞进行处理。应用免疫荧光检测培养的乳鼠心肌细胞内α-SA蛋白以此鉴定原代培养心室肌细胞纯度;实验涉及如下分组:5.5 mmol/L糖对照组(M)、30 mmol/L高糖组(MH)、30 mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2激动剂(Alda-1)组(MHA)、30 mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2抑制剂(Daidzin)组(MHD)、30 mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2激动剂(Alda-1)和NFAT3抑制剂(11R-VIVIT)组(MHAV);荧光探针检测细胞内钙离子浓度;ELISA测定细胞内CaN含量;Western blot检测ALDH2、CaN、NFAT3蛋白表达。结果与M组相比,MH组ALDH2蛋白表达降低(P<0.05),CaN蛋白表达增高(P<0.05)、NFAT3蛋白表达以及细胞内CaN含量、Ca^(2+)浓度均增高(P<0.01);与MH组相比,MHA组Ca^(2+)浓度降低(P<0.05)、细胞内CaN含量降低(P<0.01)、CaN蛋白和NFAT3蛋白表达降低(P<0.05)、ALDH2蛋白表达增加(P<0.05),MHD组Ca^(2+)浓度升高(P<0.01)、细胞内CaN含量升高(P<0.05);与MHA组相比,MHAV组的ALDH2蛋白表达量无明显变化(P>0.05),NFAT3蛋白表达量降低(P<0.05)。结论线粒体ALDH2对高糖诱导的乳鼠心肌细胞起保护作用,其机制可能与ALDH2对Ca^(2+)-CaN-NFAT3信号通路的负调节作用有关。

川芎嗪对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心脏成纤维细胞纤维化的影响

目的探讨川芎嗪(ligustrazine)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心脏成纤维细胞纤维化的机制及影响。方法体外培养SD大鼠乳鼠CFs,实验分为5组,A组(对照组):培养时不加干预药物;B组(AngⅡ组):加AngⅡ10-6mol/L;C组(川芎嗪低剂量组):AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪5 mg/L;D组(川芎嗪中剂量组)AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪10 mg/L;E组(川芎嗪高剂量组)AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪20 mg/L,干预48 h后,采用RT-PCR法测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及钙调神经磷酸酶催化亚基Aβ亚型(Cn Aβ)mRNA的表达情况;Western Blot法检测α-SMA及活化T细胞核因子3(NFAT3)的蛋白表达情况。结果与A组比较,B组α-SMAmRNA、Cn AβmRNA表达均显著增高,差异有统计学意义(P<0.05),α-SMA、NFAT3蛋白的表达也显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);与B组比较,C组α-SMAmRNA、Cn AβmRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),α-SMA、NFAT3蛋白表达无统计学意义(P>0.05),D组和E组α-SMA、Cn Aβ的mRNA表达均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),α-SMA、NFAT3蛋白表达显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在一定浓度范围,川芎嗪以剂量依赖方式抑制AngⅡ诱导的SD大鼠CFs心肌纤维化过程,其机制可能与心脏成纤组细胞纤组化川芎嗪抑制CFs的钙调神经磷酸酶(Ca N)信号通路有关。

西红花苷抑制NFATc3活性促进与肿瘤成纤维细胞共培养的结直肠癌细胞放射敏感性

目的探究西红花苷对与肿瘤成纤维细胞(CAFs)共培养的结直肠癌细胞放射敏感性的影响,并探究分子机制。方法通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印记(Western blotting)比较人正常结肠上皮细胞NCM460和结直肠癌细胞系SW480、SW620、HCT116、LOVO中活化T细胞核因子c3(NFATc3)表达差异。建立CAFs与HCT116细胞共培养体系,西红花苷处理细胞后经不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)X射线照射,细胞克隆形成实验分析细胞存活分数(SF)。再将HCT116细胞分为对照组、6 Gy组、CAFs/HCT116+6 Gy组、CAFs/HCT116+西红花苷+6 Gy组,进行对应处理后,MTT法检测各处理组HCT116细胞活性,流式细胞术检测各处理组HCT116细胞凋亡率,Hoechst 33258染色观察各处理组HCT116细胞凋亡形态,qRT-PCR和Western blotting测定各处理组HCT116细胞中NFATc3表达水平。结果相较于人正常结肠上皮细胞NCM460,人结直肠癌细胞系SW480、SW620、HCT116、LOVO中的NFATc3 mRNA和蛋白相对表达量均显著上调(P<0.05)。与HCT116细胞比较,与CAFs共培养的HCT116细胞经辐射后的SF显著增高(P<0.05);与CAFs共培养的HCT116细胞比较,与CAFs共培养的HCT116细胞经西红花苷处理再进行辐射的SF显著降低(P<0.05)。与6 Gy组比较,CAFs/HCT116+6 Gy组HCT116细胞存活率显著升高(P<0.05),细胞凋亡率显著下降(P<0.05),细胞内染色也较为均匀,未见致密浓染的凋亡状细胞,细胞中NFATc3 m RNA和蛋白相对表达量均显著上调(P<0.05);而与CAFs/HCT116+6 Gy组比较,CAFs/HCT116+西红花苷+6 Gy组HCT116细胞存活率显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05),细胞中有较多致密浓染、碎裂荧光块,同时,细胞中NFATc3 m RNA和蛋白相对表达量显著下调(P<0.05)。结论西红花苷能够明显提高与CAFs共培养的结直肠癌HCT116细胞的放射敏感性,从而促进细胞发生凋亡,该作用可能与抑制NFATc3有关。

心肌肌钙蛋白ⅠR146W突变对CaN-NFAT3信号通路的影响

目的探讨心肌肌钙蛋白ⅠArg146Trp(cTnI R146W)基因突变在钙调神经磷酸酶(CaN)-活化T细胞核因子(NFAT)3信号通路中的作用。方法将大鼠胚胎心肌细胞分为转染含cTnI R146W突变的腺病毒(A)组、转染野生型cTnI基因的腺病毒(B)组、腺病毒空载体对照(C)组和空白对照(D)组,Western blot法分别检测胞浆CaN、胞核NFAT3蛋白表达。结果各组心肌细胞中均有CaN蛋白表达,但组间差异无统计学意义(P>0.05);A组NFAT3蛋白表达显著高于B、C、D组(P<0.05)。结论 CaN-NFAT3信号通路参与cTnⅠ R146W突变导致心肌肥大的过程。

益气温阳活血方含药血清对肥大心肌细胞儿茶酚胺、钙调神经磷酸酶的影响研究

目的:探讨益气温阳活血方含药血清对鼠肥大心肌细胞儿茶酚胺、钙调神经磷酸酶的影响。方法:30只Wistar大鼠分为中药组(益气温阳活血方灌胃)、卡维地洛组(卡维地洛灌胃)、空白血清组(蒸馏水灌胃)各10只,每日给药2次,共8周。末次灌胃后处死动物,分离血清,将血清经微孔滤膜灭活、滤菌后与DMEM培养基配成10%浓度。取新生乳鼠心室肌,用0.25%胰蛋白酶消化分离,经差速纯化2h,接种于10%血清DMEM培养液中,取上述细胞加入AngⅡ作用48h诱导心肌肥大后,分为正常组(正常心肌细胞加空白血清培养)、模型组(肥大心肌细胞加空白血清培养)、中药组(肥大心肌细胞加入益气温阳活血方含药血清培养)、西药组(肥大心肌细胞加卡维地洛含药血清培养)。检测各组心肌细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)、儿茶酚胺(CA)、内皮素-1(ET-1)一氧化氮(No)含量、活化的T细胞核因子3(NFAT3)核蛋白活性、CaN mRNA及蛋白质表达水平。结果:与正常组比较,模型组心肌细胞[Ca2+]i、CA、ET-1含量、CaN mRNA的表达水平以及NFAT3核蛋白活性明显升高,NO含量明显降低。结论:益气温阳活血方能够明显减少心肌细胞[Ca2+]i、CA、ET-1含量,升高NO含量,抑制CaN mRNA和蛋白质的表达水平及NFAT3核蛋白活性,其机制可能与经由CaN信号通路活化抑制交感神经兴奋有关。